VEGF164和SEMA3A在大鼠氧致视网膜病变模型中表达的初步研究

摘要

目的：研究血管内皮生长因子164(Vascular endothelial growth factor164，VEGF164)和轴突坍塌导向因子(Semaphorin3A，SEMA3A)在氧致视网膜病变大鼠(Oxygen induced retinopathy，OIR)视网膜中的表达变化，探讨二者在视网膜中的作用及相互关系。
　　 方法：
　　 1.随机选择健康新生SD大鼠107只(214眼)，随机分为OIR组65只(130眼)和正常对照组42只(84眼)。OIR组每天交替给予氧浓度为50％和10％的氮氧混合气，于生后(Posternatal day，P)14天出舱；正常对照组于正常氧环境下饲养。分别于P18、P24随机取每组各4只(8眼)，制作视网膜铺片行ADP酶血管染色，计数视网膜新生血管的时钟位；于P12、P15、P18、P21和P24，随机取每组各2只(4眼)，制作石蜡切片行苏木素-伊红染色(Hematoxylin-eosin，HE)，计数突破内界膜的新生血管内皮细胞数。
　　 2.随机选择OIR组和正常对照组各24只(48眼)，分别于P12、P15、P18和P24，各时间点每组随机选取4只大鼠，过量水合氯醛腹腔注射致死动物后立即取眼球，左眼分离视网膜组织行RNA提取，real time PCR检测VEGF164和SEMA3A的mRNA表达；右眼分离视网膜组织提取蛋白，Western Blot检测VEGF164和SEMA3A的蛋白表达；于各时间点每组各取2只大鼠(3眼)，制作冰冻切片，行视网膜组织VEGF164和SEMA3A免疫荧光染色检查。
　　 3.随机选择OIR组23只(46眼)，于P12进行玻璃体腔注射，左眼为VEGFab组，注入1ul含100ng的抗大鼠VEGF164抗体(anti-rat VEGF164 antibody，VEGFab)(R&D公司，美国)；右眼为IgG组，注入1 ul含100ng无免疫活性的IgG(R&D公司，美国)。于P18和P24分别随机选择8只大鼠(16眼)，于各时间点每组各取4眼行视网膜组织RNA提取，real time PCR检测VEGF164和SEMA3A的mRNA表达；各4眼提取视网膜组织蛋白，Western Blot法检测VEGF164和SEMA3A蛋白表达。随机选择7只(14眼)，其中4只(8眼)于P18制作石蜡切片行HE染色，计数突破内界膜的新生血管内皮细胞数；3只(6眼)制作冰冻切片，行视网膜组织VEGF164和SEMA3A免疫荧光染色。
　　 4.在P18VEGFab组、IgG组、不进行玻璃体腔注射OIR组以及正常对照组的冰冻切片中每组各选取3张，行TUNEL染色，观察神经节细胞层、内核层和外核层的细胞凋亡。选择以上各组视网膜组织所提取的RNA，real time PCR检测Bcl-2、Bax和Caspase-3的mRNA表达。
　　 5.统计学分析：所有数据进行方差齐性检验，采用单因素方差分析及组间两两比较，以P<0.05为差异具有统计学意义。
　　 结果：
　　 1.ADP酶血管染色显示OIR大鼠视网膜血管发育迟滞并出现新生血管，P18为新生血管形成高峰期，P24血管改变基本消失。OIR组P18视网膜铺片新生血管时钟数为9.38±1.06个，P24未发现新生血管丛。OIR组各时间点突破视网膜内界膜的血管内皮细胞数明显高于同日龄对照组，且以P18为最多，差异具有统计学意义(F=9.292，P=0.000)。
　　 2.OIR大鼠视网膜VEGF164和SEMA3A mRNA和蛋白表达水平均高于正常大鼠。VEGF164和SEMA3A的mRNA表达变化在时空上具有一致性，但蛋白表达二者出现差别：VEGF164在生后15天出现高峰，而SEMA3A随时间变化表达量呈增加的趋势。免疫荧光结果显示：VEGF164主要存在于视网膜内丛状层、外丛状层、光感受器内节；SEMA3A主要存在于外丛状层和光感受器内节、外节。OIR组视网膜中VEGF164和SEMA3A的荧光强度均高于正常对照组。
　　 3.VEGFab玻璃体腔注射后，OIR大鼠视网膜VEGF164和SEMA3AmRNA和蛋白表达水平均下降。免疫荧光显示视网膜VEGF164和SEMA3A的荧光强度均下降。
　　 4.P18OIR组视网膜中Bax和Caspase-3 mRNA表达上调，TUNEL染色显示神经节细胞层、内核层和外核层凋亡细胞数明显高于正常对照组，差异均具有统计学意义(P<0.01)。VEGFab玻璃体注射后，视网膜组织Bax和Caspase-3 mRNA表达下调，Bcl-2表达上调，视网膜神经节细胞层和外核层凋亡细胞数低于IgG组，二者差异具有统计学意义(P<0.01)。
　　 结论：
　　 1.应用氧浓度为50％和10％的氮氧混合气体，成功诱导了大鼠OIR动物模型，其视网膜新生血管形成高峰期为P18。
　　 2.OIR大鼠视网膜组织VEGF164和SEMA3A表达上调，VEGFab玻璃体腔注射抑制VEGF164表达的同时SEMA3A表达下调，VEGF164可能影响SEMA3A的表达。
　　 3.OIR大鼠视网膜凋亡主要出现在神经节细胞层、内核层和外核层。VEGFab玻璃体腔注射后，视网膜细胞凋亡得到部分改善，推测VEGF164和SEMA3A可能共同参与并调控OIR大鼠视网膜血管和神经病变的发生。