肠杆菌科临床耐药株中ISCR1元件与耐药基因水平传播的关系研究

摘要

插入序列共同区域(insertion sequence common region，ISCR)是继接合性质粒、整合子、转座子之后的一种新型的的高效的耐药基因水平传播媒介。肠杆菌科细菌中发现较多的是位于复合1类整合子中的ISCR1元件，其下游可连接多种耐药基因：如A类和C类β-内酰胺酶基因、喹诺酮耐药基因qnr、氨基糖苷类耐药基因armA和rmtB、甲氧苄啶耐药基因和氯霉素耐药基因等。
　　 目的：了解2009年-2010年天津市某三甲医院104株肠杆菌科临床耐药株的耐药表型以及ISCR1元件的分布；研究ISCR1阳性肠杆菌科临床株质粒介导的耐药机制，及ISCR1元件下游的基因环境，以探讨ISCR1元件在细菌耐药性播散中的作用。
　　 方法：自2009年1月至2010年7月从天津市某三甲医院收集104株肠杆菌科临床耐药株；采用微量肉汤稀释法检测104株细菌对12种常用抗菌药物的MIC值。PCR及DNA序列分析检测ISCR1元件中的orf513基因。双纸片扩散法进行ESBLs确证试验、三维试验筛选AmpC酶；PCR、多重PCR、PCR-SSCP及DNA序列分析检测CTX-M-ESBLs基因1组和9组、SHV、TEM、ampC、qnrA、qnrB、rmtB及armA基因。PCR-mapping及DNA序列分析检测ISCR1下游基因环境。
　　 结果：
　　 1、104株肠杆菌科临床耐药株对12种常用抗菌药物CPR、CFP、CRO、CTX、GM、PPT、CAZ、CIP、OFX、LEV、AMK、CPS耐药率分别为：83.65％、80.77％、78.85％、73.08％、67.31％、66.35％、64.42％、64.42％、57.69％、46.15％、26.92％、22.12％。多重耐药株共58株，多重耐药株比率55.77％(58/104)。
　　 2、104株肠杆菌科临床耐药株中17株细菌(16.35％)PCR扩增ISCR1元件的orf513基因阳性，序列分析证实为orf513基因。其中大肠埃希菌5株(EA291、EA705、EA791、EA907、EA1904)，克雷伯菌属4株(K382、K386、K1231、K2414)，阴沟肠杆菌5株(EC347、EC553、EC1322、EC1342、EC2394)，1株产气肠杆菌(E391)、1株弗劳地枸橼酸杆菌(CF351)及1株吉戈菲肠杆菌(JE982)。
　　 3、17株ISCR1阳性菌株对10种抗菌药物耐药率高于87株ISCR1阴性菌株。17株ISCR1阳性菌株中多重耐药菌株比率为70.59％(12/17)高于87株ISCR1阴性菌株多重耐药菌株比率52.87％(46/87)。
　　 4、17株ISCR1阳性肠杆菌科临床耐药株中EA791、K386、EC553、EC1322、EC1342等5株细菌ESBLs确证试验阳性。菌株EA791、K386、EC553等3株细菌携带CTX-M-1组ESBLs基因；未扩增出CTX-M-9组ESBLs基因；EC1322、EC1342等2株细菌携带SHV-12基因；所有5株细菌PCR扩增TEM基因均阳性，经PCR-SSCP分析均为TEM-1(广谱β-内酰胺酶)。三维试验筛选AmpC酶仅菌株EA291为阳性结果，多重PCR扩增证实为DHA型AmpC酶基因。
　　 5、17株ISCR1阳性肠杆菌科临床耐药株中EC2394、CF351等2株细菌携带喹诺酮耐药基因qnrA；K1231、EC347、EC1322、EC1342等4株细菌携带喹诺酮耐药基因qnrB；K1231、EC1322、EC1342等3株细菌对喹诺酮类抗菌药物敏感，余3株细菌表现为耐药。菌株K386携带氨基糖苷类耐药基因rmtB，EA1904、K382、K386、EC553、JE982等5株细菌携带氨基糖苷类耐药基因armA。
　　 6、PCR-mapping扩增及序列分析17株ISCR1阳性肠杆菌科临床耐药株中ISCR1元件下游的基因环境，EC1322、EC1342等2株细菌ISCR1元件下游连接喹诺酮耐药基因qnrB2；EC2394、CF351等2株细菌ISCR1元件下游连接喹诺酮耐药基因qnrA；K1231、EC347等2株细菌ISCR1元件下游连接喹诺酮耐药基因qnrB6；菌株JE982的ISCR1元件下游连接氨基糖苷类耐药基因armA。余10株细菌检测结果阴性。
　　 结论：
　　 1、本地区肠杆菌科临床耐药株中存在ISCR1元件的分布。ISCR1阳性菌株对多种抗菌药物耐药率及多重耐药菌株比率均高于ISCR1阴性细菌。
　　 2、ISCR1阳性肠杆菌科临床耐药株同时携带多种质粒介导的耐药基因：包括ESBLs基因CTX-M-1组、SHV-12，DHA型ampC基因，喹诺酮耐药基因qnrA、qnrB，氨基糖苷类耐药基因rmtB、armA。以上β-内酰胺类、氨基糖苷类基因型与耐药表型一致，携带qnr基因的菌株不一定对喹诺酮类抗菌药物耐药。
　　 3、本地区肠杆菌科临床耐药株中ISCR1元件下游多与喹诺酮耐药基因qnr连接，少数与氨基糖苷类耐药基因armA连接，未发现连接ESBLs及AmpC酶基因。推测本地区ISCR1元件可能参与了喹诺酮类、氨基耐糖苷类耐药基因的水平传播。部分菌株未检测出ISCR1元件下游基因环境，可能与ISCR1下游存在不适宜应用PCR-mapping方法的基因结构有关，有待改进研究方法进一步深入研究。