恩度联合顺铂对荷瘤动物肿瘤血管正常化及循环血管内皮细胞的影响

摘要

目的：
　　观察重组人血管内皮抑制素(rh-endostatin，商品名：恩度，endostar)导致荷瘤动物循环血管内皮细胞(circulating endothelial cells，CECs)、肿瘤血管形态及血管生成相关因子的变化，阐明反应“血管正常化”时间窗的标志物，比较在此时间窗内及外实施化疗的抗肿瘤效应、探索抗血管生成联合化疗的最佳用药时间与顺序。
　　方法：
　　单药实验随机分为对照组(生理盐水200ul/d，第1～14天)、恩度组(恩度400ug/d，第1～14天)和顺铂组(顺铂4mg/kg/d，第1～5天)。联合用药实验随机分为对照组(生理盐水200ul/d，第1～14天)、同时用药组(恩度400ug/d，第1～14天；顺铂4mg/kg/d，第1～5天)、先恩度组(恩度400ug/d，第1～14天；顺铂4mg/kg/d，第5～9天)和先顺铂组(顺铂4mg/kg/d，第1～5天；恩度400ug/d，第6～19天)。动态测量移植瘤体积，流式细胞术动态监测CECs变化，激光共聚焦显微镜观察微血管形态变化、Image Pro Plus6.0软件统计血管渗漏面积、免疫组化方法检测治疗后EMMPRIN、VEGF、MMP2、MMP9、TIMP-1、TIMP-2、HIF-1α表达及微血管密度(MVD)、胶原覆盖率的变化。
　　结果：
　　1.动物实验结果：单药恩度组(182.408 mm3±46.379 mm3)和单药顺铂组(234.774mm3±59.588mm3)治疗前后肿瘤体积的差值均低于对照组。先恩度组对肿瘤生长抑制作用较其他联合组更明显。各组小鼠体重变化无明显差异(P>0.05)。
　　2.流式细胞术检测外周血CECs结果：与对照组比较，单药恩度组aCECs用药第7天升高(P=0.003)，第10天下降(P=0.026)；凋亡CECs第10天升高(P=0.033)。先恩度组和先顺铂组aCECs均较对照组降低。各联合组凋亡CECs数量均较对照组升高。
　　3.微血管形态变化结果：恩度治疗第7天和第10天血管分枝较少、血管变直、血管密度下降、血管壁渗透性降低。
　　4.MVD及血管胶原覆盖率的结果比较：恩度给药第7天和第10天MVD降低、胶原覆盖率增加。各联合治疗组MVD均降低、微血管胶原覆盖率均增加。
　　5.免疫组化染色结果：恩度给药第7天HIF-1α表达降低。EMMPRIN、VEGF、MMP-2和MMP-9的表达均于第4天明显降低。TIMP-1和TIMP-2的表达于给药第4天和第7天升高。先恩度组及先顺铂组可降低HIF-1α表达。各联合治疗组均可下调EMMPRIN、VEGF、MMP-2和MMP-9的表达，上调TIMP-2的表达。
　　6.各指标间的相关性分析：HIF-1α，EMMPRJN，VEGF，MMPs，MVD之间存在正相关关系，HIF-1α与肿瘤体积呈正相关关系，VEGF，MMP-9及HIF-1α均与TIMP-1和TIMP-2呈负相关关系，肿瘤血管胶原覆盖率与MVD，VEGF，HIF-1α，MMP-2及MMP-9呈负相关关系，与TIMP-1及TIMP-2呈正相关关系。
　　结论：
　　恩度可以通过改变促血管生成因子与抗血管生成因子间的平衡，使肿瘤血管及其微环境在第4-10天实现短暂正常化，且在正常化时间窗内联合使用化疗药物抗瘤作用最明显；aCECs在血管正常化时间窗内表现为先上升后下降的过程，且在aCECs下降时凋亡CECs升高，aCECs早期升高可能提示新生血管床面积减小及血管正常化的开始、继而下降同时凋亡CECs升高反映肿瘤新生血管能力下降及血管正常化时间窗的结束。动态监测CECs可帮助确定肿瘤血管正常化时间窗，为联合用药的最佳时间提供依据。