CD44v6在人膀胱癌组织的表达及其对膀胱癌细胞生物学行为的影响

摘要

目的：在我国，膀胱癌发病率居泌尿系统肿瘤首位，具有易复发、易侵袭、易产生获得性耐药等特点，其治疗效果并不理想。新的膀胱癌药物的研发成为膀胱癌治疗领域更待解决的问题。我们的前期研究发现，膀胱癌干(起始)细胞就存在于EMA-CD44v6+亚群，且这群以CD44v6蛋白为标记物的癌细胞很可能是膀胱癌复发和转移的主要原因。人类多种恶性肿瘤组织中普遍存在CD44v6表达失控，其高表达被认为与肿瘤的发生、发展及转移有关。鉴于此，本课题检测了细胞黏附分子CD44v6和上皮膜抗原EMA在膀胱尿路上皮细胞两类癌中的表达情况，利用特异性封闭型抗CD44v6单克隆抗体封闭，探讨其对膀胱癌T24细胞生物学行为的影响，并对可能的分子机制进行初步探讨。
　　方法：1、本研究收集40例外科手术切除膀胱癌标本和5例正常膀胱组织，应用免疫组织化学(PowerVision两步法)检测不同病理分期及组织分级的BTCC标本和正常膀胱粘膜中，EMA和CD44v6蛋白的表达，系统分析它们与临床病理参数之间的关系，研究二者在膀胱癌不同病理分期及组织分级的表达情况。2、体外培养膀胱癌细胞T24和正常膀胱粘膜上皮，采用免疫细胞化学法检测膀胱癌细胞T24和正常膀胱尿路上皮细胞中，CD44v6蛋白的表达情况。3、通过抗体封闭的手段，用不同浓度的anti-CD44v6单抗分别与人膀胱癌细胞T24共同培养24h、48h、72h后，MTT法观察细胞生长情况，流式细胞仪FCM检测细胞凋亡情况。免疫细胞化学法检测调亡相关蛋白Bax和bcl-2的胞内表达情况。4、Transwell侵袭迁移实验观察anti-CD44v6单抗作用后，膀胱癌细胞T24侵袭迁移能力的变化。
　　结果：1、EMA和CD44v6在膀胱癌中的阳性表达率分别为92.5％和57.5％。EMA的表达率与膀胱肿瘤组织学分级和分期无关(P>0.05)。随着膀胱癌进展，CD44v6表达显著下降，与病理分级及分期有关(P<0.01)。正常和癌性尿路上皮中EMA-细胞位于可能的干细胞位置(基底细胞层)，EMA+细胞总是位于相对成熟的位置(靠近上皮腔面)。正常和癌性尿路上皮中CD44v6+细胞位于可能的干细胞位置(基底细胞层)，CD44v6-细胞总是位于相对成熟的位置(靠近表层)。2、膀胱癌细胞株T24中，CD44v6蛋白均一表达，主要表达在细胞膜，呈均匀棕黄色染色，细胞浆内有染色少许或无色，而正常膀胱尿路上皮细胞几乎不表达CD44v6蛋白。3、MTT法检测结果显示，通过anti-CD44v6单抗封闭，可抑制T24细胞的生长(P<0.05)，诱导T24细胞凋亡(P<0.01)，并且bcl-2蛋白表达降低，Bax蛋白表达增加(P<0.01)。光镜下可见经抗体封闭的细胞形态学的改变。4、与anti-CD44v6单抗封闭前相比，经anti-CD44v6单抗封闭处理之后，可见穿膜细胞数目明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。
　　结论：1、依据免疫组化结果，表明CD44v6+和EMA-可能是膀胱癌干(起始)细胞表面标志。2、膀胱癌细胞T24经anti-CD44v6单抗封闭后，细胞的增殖受到抑制，呈时间剂量依赖关系。经anti-CD44v6单抗封闭后，凋亡率增加，推测其机制可能与凋亡调控基因bcl-2和Bax表达水平变化有关。3、CD44v6蛋白与肿瘤细胞的侵袭迁移运动密切相关，anti-CD44v6单抗封闭可以抑制T24细胞侵袭迁移能力。

目录

文摘

英文文摘

缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、EMA和CD44v6在膀胱癌组织中的表达及其临床意义

1.1 材料和方法

1.1.1 用于免疫组化的主要试剂及仪器设备

1.1.2 实验方法

1.1.3 结果判定

1.2 结果

1.2.1 EMA在两类膀胱尿路上皮细胞癌中的表达

1.2.2 CD44v6在两类膀胱尿路上皮细胞癌中的表达

1.3 讨论

1.4 小结

二、抗CD44v6抗体阻断对膀胱癌细胞T24增殖与凋亡的影响

2.1 材料和方法

2.1.1 材料

2.1.2 实验方法

2.2 结果

2.2.1 CD44v6蛋白在正常膀胱粘膜和膀胱癌细胞系T24中的表达

2.2.2 流式细胞仪分析T24细胞表面CD44蛋白的表达

2.2.3 抗CD44v6抗体封闭抑制膀胱癌T24细胞增殖

2.2.4 抗CD44v6抗体封闭诱导膀胱癌T24细胞凋亡

2.2.5 免疫细胞化学法检测凋亡相关蛋白Bax、bcl-2的胞内表达

2.3 讨论

2.4 小结

三、抗CD44v6抗体阻断对膀胱癌细胞T24迁移侵袭的影响

3.1 材料和方法

3.1.1 材料

3.1.2 实验方法

3.2 结果

3.2.1 抗CD44v6抗体封闭抑制膀胱癌T24细胞迁移

3.2.2 抗CD44v6抗体封闭抑制膀胱癌T24细胞侵袭

3.3 讨论

3.4 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述

综述参考文献

致谢