1,25(OH)2D3通过下调TLR4介导的炎症途径对DM大鼠心血管的作用

摘要

背景：糖尿病(DM)的发病率逐年增高，DM和其慢性并发症已成为威胁人类健康的主要疾病之一。糖尿病心血管并发症的防治已成为临床工作中的重点，对其的认识已从糖脂代谢紊乱过渡到免疫和炎症机制。研究表明TLR4介导的固有免疫的不适当活化和炎症途径参与了DM和心血管疾病。维生素D不足是心血管疾病发生的独立危险因素。除了对骨代谢的经典作用外，1，25(OH)2D3作为不同细胞类型的免疫功能调节剂被广泛认可。1，25(OH)2D3能否通过下调血管内皮细胞、平滑肌细胞和心肌细胞TLR4介导的炎症途径而发挥心血管保护作用，尚未见到相关报道。
　　目的：本研究观察不同剂量的1，25(OH)2D3能否通过下调主动脉和心脏TLR4介导的炎症途径对STZ诱导的糖尿病大鼠心血管发挥保护作用。体外实验观察1，25(OH)2D3能否通过此途径对血管平滑肌细胞发挥直接作用。
　　方法：采用尾静脉注射STZ的方法制造DM大鼠模型。将实验大鼠随机分为7组：正常对照组(C组)、糖尿病未干预组(D组)、低剂量1，25(OH)2D3组(L组，0.025μg/kg/d)、中剂量1，25(OH)2D3组(M组，0.15μg/kg/d)、高剂量1，25(OH)2D3组(H组，0.3μg/kg/d)、精蛋白锌胰岛素组(Y组，16U/kg/d)及氯沙坦钾组(A组，10.4mg/kg/d)。成模16周后处死动物，留取血、尿标本检测血糖、血脂、肝肾功能、骨代谢指标、C反应蛋白和尿微量白蛋白。观察各组大鼠主动脉和心脏的形态学变化；应用免疫组化和免疫荧光方法检测其TLR4、MyD88、NF-κB p65、MCP-1和TRAIL的组织表达；real-time qPCR和Western blotting方法检测其组织的mRNA和蛋白的表达。体外实验采用低糖(5.5mmol/L)和高糖(25mmol/L)培养基培养A7R5大鼠主动脉平滑肌细胞，观察不同浓度和培养时间的TLR4的表达水平的变化。选取TLR4表达量最高的糖浓度和时间点，应用不同浓度的1，25(OH)2D3(1×10-9mol/L、1×10-8mol/L、1×10-7mol/L)以及氯沙坦钾(1×10-5mol/L)进行干预。并收集该时间点的各组细胞，应用real-time qPCR法检测TLR4和MyD88的mRNA表达，细胞免疫荧光法和Western blotting法检测TLR4和MyD88的蛋白表达。各组间数据采用单因素方差分析进行比较。
　　结果：1.与D组大鼠相比，中剂量1，25(OH)2D3组的尿钙升高，但未表现出剂量依赖性。2.D组大鼠主动脉出现内皮粗糙，平滑肌增粗排列紊乱。心肌细胞可出现变性、坏死。均可出现炎症细胞浸润和纤维化。TLR4、MyD88、NF-κB p65、MCP-1和TRAIL在主动脉和心脏高表达。高剂量1，25(OH)2D3、胰岛素和氯沙坦钾能够改善主动脉和心脏的病理表现，能够下调TLR4、MyD88、NF-κB p65、MCP-1和TRAIL的组织表达，中、低剂量1，25(OH)2D3的作用不显著。3.体外高糖可以诱导VSMC的TLR4表达，高糖培养VSMC的TLR4表达在一定范围内存在时间及浓度依赖性。1×10-7mol/L的1，25(OH)2D3能够下调高糖环境下VSMC的TLR4及MyD88的表达。1×10-9mol/L和1×10-8mol/L的1，25(OH)2D3以及氯沙坦钾作用不显著。
　　结论：1.高剂量1，25(OH)2D3治疗能够下调主动脉和心脏TLR4介导的炎症途径，降低DM心血管并发症的风险。而中、小剂量1，25(OH)2D3作用不显著，提示1，25(OH)2D3对DM心血管的保护作用需要合适的治疗剂量。临床应用应最大程度地发挥骨外的保护作用，同时还需要注意监测骨代谢指标，对于可能有影响的患者可考虑应用VDR激动剂。2.1×10-7mol/L浓度的1，25(OH)2D3能够抑制高糖环境下VSMC的TLR4及MyD88的表达，可以通过减少下游炎症因子的表达，维持其正常的结构和功能。3.氯沙坦钾能够在DM大鼠模型中下调主动脉和心脏TLR4介导的炎症途径，而在体外实验中并未能下调TLR4和MyD88的表达，表明其作用途径与阻断ATII通路有关。