实时荧光PCR熔解曲线法快速鉴定嗜肺军团菌

摘要

目的：
　　建立特异、快速、敏感的实时荧光PCR熔解曲线基因分型方法，并探讨该法在临床痰标本和环境水样中鉴定嗜肺军团菌的应用价值。
　　方法：
　　(1)根据嗜肺军团菌16SrRNA基因保守序列设计引物和焠灭FRET探针建立实时荧光PCR熔解曲线方法。
　　(2)优化引物与探针浓度，用嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他病原菌标准菌株验证该方法的特异性、敏感性和重复性，并做模拟实验。
　　(3)117份痰标本进行实时荧光PCR熔解曲线法鉴定，鉴定结果通过基因测序法检测结果验证。
　　(4)对18份环境水样进行培养，生化表型，普通PCR，实时荧光PCR熔解曲线鉴定，鉴定结果通过基因测序法检测结果验证。
　　结果：
　　(1)引物序列：上游引物5’-AGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3’，下游引物5’-CCAACAGCTAGTTGACATCG-3’。探针序列：锚定探针序列5’-CCCATACTCGAGTCAACC(FAM)-3’，感应探针序列5’-(BHQ1)TATTATCTGACCGTCCCAG(ph)-3’。
　　(2)优化后的反应体系：10×PCR酶体系15.5μl，上游引物(40.0pmol/μL)1.0μl，下游引物(2.0pmol/μl)2.0μl，锚定探针(10pmol/μl)1.0μl，感应探针(10pmol/μl)0.5μl，模板5μl。
　　优化后的反应程序：(RocheLightcycler480实时荧光PCR仪)：95℃3min；95℃10s，57℃20s，72℃30s，50个循环；熔解分析程序为：95℃1min；40℃2min；40℃升温至85℃，1℃/5s。FAM通道下检测荧光。
　　使用实时荧光PCR熔解曲线基因分型方法检测的15株嗜肺军团菌、30株非嗜肺军团菌、7株其他病原菌中，15株不同血清型的嗜肺军团菌Tm值均为57℃；7株非嗜肺军团菌Tm值为43℃，1株Tm值为45℃；其余22株非嗜肺军团菌和7株其他病原菌均无明显Tm值。该方法检测的灵敏度可达100fg/μl。
　　(3)117例痰标本经培养未发现嗜肺军团菌阳性。
　　117例痰标本中经实时荧光PCR熔解曲线基因法检测，发现有3例嗜肺军团菌，与基因测序法检测结果一致。
　　(4)环境水样经培养，得到可疑军团菌22株，经普通PCR鉴定，发现20株军团菌阳性。
　　环境水样经培养，22株可疑军团菌菌株经实时荧光PCR熔解曲线法鉴定嗜肺军团菌阳性的菌株共9株。与基因测序法检测结果一致。
　　环境水样直接提取DNA，普通PCR后军团菌阳性的标本：4号，5号，8号，9号，13号，14号，15号，16号，17号，18号，经基因测序法验证后，进一步显示5、9号标本为嗜肺军团菌，13、14、15号标本为辛辛那提军团菌，16、17、18号标本为长滩军团菌。
　　环境水样直接提取DNA、实时荧光PCR熔解曲线法鉴定嗜肺军团菌阳性标本：未发现阳性标本。
　　结论：
　　(1)建立的实时荧光PCR熔解曲线法能够明确的对嗜肺军团菌鉴定，并可对部分军团菌进行分型。
　　(2)在对117例临床标本的鉴定中，检测出3例嗜肺军团菌，鉴定结果与PCR-基因测序方法一致。
　　(3)对环境水样检测过程中，通过采用分离培养、生化表型、实时荧光PCR熔解曲线法、基因测序方法的鉴定，发现环境水源能分离出军团菌，对分离菌株进一步的分型和鉴定，可采用实时荧光PCR熔解曲线法、基因测序方法。
　　(4)实时荧光PCR熔解曲线法除具有传统实时荧光PCR高灵敏、高特异性、高精确度及污染小等优点外，焠灭探针荧光标记技术要求低，价格更便宜，耗时短，因此，该方法更适用于军团菌病的预防和临床诊断，尤其是在军团菌病暴发流行时，可提供快速的实验室诊断。