TNF-α、MMP-2,MAPK和NF-κB在人类子宫肌瘤发病机制中的作用

摘要

目的：
　　子宫肌瘤是女性生殖器官中最常见的良性肿瘤，发病机理不楚。已有研究证明在正常子宫肌转变成子宫肌瘤以及子宫肌瘤体积增长的过程中均伴随着肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factors-alpha，TNF-α)和肿瘤坏死因子受体I(tumor necrosis factor receptor I，TNF RI)表达的变化。检测TNF-α、MMP-2、MAPK和NF-κB在人子宫肌瘤中的表达，探讨其在子宫肌瘤发病中的作用，为临床治疗提供理论依据。
　　方法：
　　(1)收集子宫肌瘤组织和邻近正常的子宫肌组织为对照，采用Western blot和real-time PCR检测组织中TNF-α的表达；(2)采用酶消化法分离培养人子宫平滑肌细胞(Human myometrium smooth muscle cells，HM-SMCs)及人子宫肌瘤平滑肌细胞(Human leiomyoma smooth muscle cells，HL-SMCs)，Western blot，real-time PCR检测细胞中TNF-α、MMP-2的表达情况；(3)20 ng/mlTNF-α处理HM-和HL-SMCs，作用0，5min，15min，30min，60min，Western blot检测p44/42MAPK、IκBα的表达及磷酸化变化；20ng/mlTNF-α处理HM-和HL-SMCs作用0，2h，12h，24h，48h，检测MMP-2蛋白表达，real-time PCR检测MMP-2 mRNA的表达；(4)用p44/42 MAPK信号通路抑制剂PD98059处理细胞后检测p44/42MAPK的表达及磷酸化；用NF-κB信号通路抑制剂Bay11-7082处理细胞后检测IκBα的表达及磷酸化变化；Western blot检测PD98059、Bay11-7082预处理后TNF-α诱导的MMP-2的变化。
　　结果：
　　1.与相应的正常子宫肌相比，卵泡期子宫肌瘤组织中的TNF-α、MMP-2表达升高，而黄体期子宫肌和子宫肌瘤的表达差异不明显。TNF-α处理细胞后，用Western blots和Real-time PCR方法检测MMP-2的时间依赖性变化，结果显示卵泡期HL-SMCs中MMP-2表达量随TNF-α的作用时间延长而升高。TNF-α作用24h、48h时，MMP-2表达显著升高，而在卵泡期HM-SMCs中TNF-α作用时间与MMP-2的表达无明显关系。
　　2.TNF-α能够激活卵泡期HL-SMCs中的p44/42 MAPK信号通路，且呈时间依赖性激活，TNF-α作用15min时最明显；并且MEK抑制剂PD98059能够抑制TNF-α诱导的p44/42 MAPK磷酸化；卵泡期HM-SMCs中phospho-p44/42MAPK无明显改变。
　　3.TNF-α诱导的total-IκBα和phospho-IκBα在卵泡期HM-和HL-SMCs中的变化趋势基本一致，TNF-α作用5min时phospho-IκBα升高最明显；NF-κB信号通路抑制剂Bay117082能够抑制卵泡期HL-SMCs中TNF-α对phospho-IκBα的诱导作用，对卵泡期HM-SMCs中TNF-α诱导的IκBα磷酸化无明显抑制作用。
　　4.用PD98059和Bay11-7082对细胞预处理后，可明显抑制卵泡期HL-SMCs中TNF-α诱导的MMP-2蛋白表达上调。
　　结论：
　　卵泡期子宫肌瘤中高表达TNF-α、MMP-2，TNF-α可时间依赖性激活卵泡期HL-SMCs中NF-κB信号通路和p44/42 MAPK信号通路，并且可通过p44/42MAPK、NF-κB信号通路促进卵泡期子宫肌瘤中MMP-2的表达，为TNF-α在子宫肌瘤的发病中的重要作用提供了新的依据。

目录

文摘

英文文摘

缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

材料与方法

1 材料

1.1 主要组织和细胞

1.2 主要实验仪器

1.3 主要试剂

1.4 主要储备液及工作液的制备

2 试验方法

2.1 人的HM-及HL-SMCs原代细胞分离

2.2 细胞培养

2.3 Western Blot

2.4 Trizol法提RNA

2.5 分光光度计测RNA样品的OD值

2.6 逆转录PCR

2.7 Real-time PCR

2.8 采用real-time的方法检测子宫肌和子宫肌瘤中TNF-αmRNA、MMP-2 mRNA的表达量

2.9 统计学分析

结果

1 TNF-α在人类子宫肌和子宫肌瘤中的表达情况

1.1 TNF-α在卵泡期人子宫肌瘤组织中高表达

1.2 TNF-α在卵泡期HL-SMCs中高表达

2 TNF-α上调卵泡期子宫肌瘤中MMP-2的表达

2.1 MMP-2在卵泡期子宫肌瘤组织中高表达

2.2 MMP-2在卵泡期HL-SMCs中高表达

2.3 TNF-α促进卵泡期HL-SMCs中MMP-2表达呈时间依赖性上升

3 TNF-α对卵泡期子宫肌瘤中MAPK信号通路的激活

3.1 TNF-α对卵泡期HL-SMCs中phospho-p44/42 MAPK的时间依赖性激活

3.2 PD98059抑制TNF-α对phospho-p44/42 MAPK的激活

4 TNF-α对卵泡期子宫肌瘤中NF-кB信号通路的激活

4.1 TNF-α对对卵泡期HL-SMCs中phospho-IкB的时间依赖性激活

4.2 Bay抑制TNF-α对phospho-IкBα的激活

5 TNF-α通过p44/42 MAPK、NF-кB信号通路促进卵泡期子宫肌瘤中MMP-2的表达

5.1 PD98059抑制卵泡期子宫肌瘤中TNF-α对MMP-2的促进作用

5.2 Bay11-7082抑制卵泡期子宫肌瘤中TNFα对MMP-2的促进作用

讨论

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述

综述参考文献

致谢