骨髓增生异常综合征异常造血克隆相关分子标志的研究

摘要

目的：
　　从免疫表型、分子生物学等方面寻找与骨髓增生异常综合征(Myelodysplastic Syndromes，MDS)异常造血克隆相关分子标志，并研究该分子标志在MDS中的作用及其临床意义。
　　方法：
　　研究对象为天津医科大学总医院自2010年3月至2012年3月新诊断的MDS患者63例、急性髓系白血病(AML)13例及正常对照40名。第一部分采用流式细胞术(FCM)检测白介素-3受体α(CD123)和粘附因子CD96在MDS患者骨髓中的表达情况，从免疫表型方面寻找MDS异常造血克隆的分子标志，并检测CD96阳性细胞的异常特征。第二部分采用半定量RT-PCR的方法检测TET2(TET癌基因家族成员2)基因在MDS患者骨髓中的表达情况，并分析其临床意义，从分子生物学角度探寻恶性克隆的分子标志。采用荧光定量PCR的方法检测TET2和DLK1(delta like1)基因在MDS患者骨髓中CD3+和CD34+细胞中的表达情况，并分析其临床意义。第三部分体外培养正常对照骨髓CD34+细胞，采用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术敲低TET2的表达；应用流式细胞术检测评价细胞增殖和凋亡等生物学特征变化，以探讨其在MDS中的作用。第四部分体外培养MDS患者骨髓CD34+CD38-细胞，采用RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术敲低DLK1的表达；应用流式细胞术检测评价细胞增殖和凋亡等生物学特征变化，进一步明确该分子标志在MDS异常造血克隆中的作用。
　　结果：
　　第一部分 MDS患者CD34+CD38-细胞占CD34+的比例为(22.72±23.91)％，显著高于正常对照组(8.63±9.35)％(P<0.01)，低于AML组(25.15±22.70)％；MDS患者骨髓CD34+CD38-细胞中CD96+及CD123+细胞比例(21.18±24.06，31.62±28.42)％显著高于正常对照组(11.23±17.91，9.29±12.63)％(P<0.01)。高危MDS组CD34+CD38-细胞中CD96+及CD123+细胞比例(26.25±27.64，37.56±31.01)％显著高于低危组(11.44±10.88，15.53±10.96)(P<0.05)；CD34+CD38-CD96+细胞中CD114(7.23±10.25％)，CD110(0.52±1.23％)及AnnexinV(2.96±3.84％)表达率均明显低于其在CD34+CD38-CD96-细胞中表达率(24.35±21.74％，12.03±10.91％，13.69±17.98％，P<0.05)。
　　第二部分 MDS患者BMMNC中TET2 mRNA表达明显低于正常对照(P<0.05)，MDS各亚组TET2 mRNA表达无差异。MDS患者TET2 mRNA表达≥0.9者原始细胞比例(1.04%±1.68％)明显低于<0.9者(6.13％±8.17％，P<0.05)。以骨髓异常染色体核型细胞数目占总分裂像细胞数目的比值作为MDS患者恶性克隆负荷，TET2基因的相对表达量随恶性克隆负荷增高而降低(r=-0.398，P<0.05)；并随IPSS指数的增高而降低(r=-0.480，P<0.05)。
　　MDS患者骨髓CD3+T细胞中TET2 mRNA表达是正常对照组的(0.16±0.15)倍(P<0.001)；TET2 mRNA表达水平与血清补体C3呈显著正相关(r=0.404，P<0.05)；MDS患者骨髓CD3+T细胞中DLK1 mRNA表达是正常对照组的(1.61±0.88)倍(P<0.05)；依据染色体分组，染色体异常组DLK1表达水平是染色体正常组的(1.45±0.44)倍(P<0.05)；DLK1 mRNA表达水平与骨髓原始细胞比例呈显著正相关(r=0.343，P<0.05)。MDS患者骨髓CD34+细胞中TET2mRNA表达显著低于正常对照组[(0.58±0.26)vs(1.25±0.94)](P<0.005)；MDS患者骨髓CD34+细胞中DLK1 mRNA表达显著高于正常对照组[(2.72±1.02)vs(1.31±1.00)](P<0.001)。
　　第三部分正常人骨髓CD34+细胞转染siRNA靶向TET2后，TET2被敲低，其mRNA表达及蛋白表达水平下降；20例正常对照者CD34+细胞对照组和siRNA-scr转染组细胞G0/G1期分别(93.60±5.54)％和(92.65±7.06)％，S期分别为(5.95±5.53)％和(6.92±7.04)％；G2/M期分别为(0.53±1.07)％和(0.30±0.42)％；siRNA-TET2转染组细胞G0/G1期为(90.82±8.25)％，S期细胞增加为(8.50±8.31)％，G2/M期为(0.47±0.89)％，G0/G1期和S期比例与对照组差别具有统计学意义(P<0.005)。siRNA-TET2转染组细胞凋亡率较CD34+细胞对照组和siRNA-scr转染组细胞凋亡率显著降低[(23.28±9.73)％vs(26.20±9.78)％vs(26.17±9.88)％](P<0.05)。
　　第四部分 MDS患者骨髓CD34+CD38-细胞转染siRNA靶向DLK1后，DLK1被敲低，其mRNA表达及蛋白表达水平下降；23例MDS患者骨髓CD34+CD38-细胞对照组和siRNA-scr转染组细胞G0/G1期分别(91.22±10.82)％和(91.29±10.39)％，S期分别为(8.38±10.65)％和(8.41±10.33)％；G2/M期分别为(0.40±0.55)％和(0.34±0.49)％；siRNA-DLK1转染组细胞G0/G1期为(95.81±3.87)％，S期细胞降低为(3.90±3.61)％，G2/M期为(0.29±0.46)％，G0/G1期和S期比例与对照组差别具有统计学意义(P<0.05)。siRNA-DLK1转染组细胞凋亡率较CD34+CD38-细胞对照组和siRNA-scr转染组细胞凋亡率显著增加[(38.97±14.32)％vs(32.94±12.64)％vs(33.48±12.44)％](P<0.001)。
　　结论：
　　(1)MDS患者骨髓中CD34+CD38-CD96+细胞与CD34+CD38-CD123+细胞增高，这些细胞存在分化异常、凋亡逃逸等恶性特征，且与骨髓原始细胞比例呈正相关。
　　(2)TET2基因在MDS患者骨髓单个核细胞、CD3+T细胞及CD34+细胞中表达减低，提示TET2基因可能是MDS的“保护基因”，其表达水平可作为评价MDS患者病情的辅助指标；MDS患者骨髓CD3+T细胞及CD34+细胞中DLK1mRNA表达增高，提示DLK1基因在MDS发生发展过程中起到一定作用。同时MDS患者骨髓CD3+T细胞TET2及DLK1基因的表达异常，提示CD3+T细胞有“质”的异常，这可能是导致机体免疫监视功能下降的机制之一。
　　(3)敲低TET2后，正常人骨髓CD34+细胞凋亡率降低，细胞周期S期增加，具有恶性变的倾向，由此推测TET2表达不足是导致髓系恶性肿瘤形成的机制之一。
　　(4)敲低DLK1后，MDS患者骨髓CD34+CD38-细胞恶性程度减低，即凋亡增加，S期减少，G0/G1期阻滞，由此推测DLK1表达增加可能是导致MDS发生发展的机制之一。