骨髓增生异常综合征肿瘤标志物及相关分子生物学机制的研究

摘要

本研究分为三部分：
　　第一部分、应用蛋白质芯片技术研究骨髓增生异常综合征肿瘤相关标志物
　　骨髓增生异常综合征(MDS)是一类异质性较高的疾病。部分患者可在发病后1年内即转变成急性白血病(AML)，这里称之为tMDS(transformedMDS)；而另一些患者则可长期保持稳定而不进展为AML，称作sMDS(stable MDS)。Kunju等人(2009)对MDS骨髓CD34+细胞的cDNA芯片研究中显示，这两组预后不同的MDS患者具有不同的基因表达谱(GEP)特点。而作为一种高通量的蛋白质研究技术，蛋白质芯片在研究肿瘤标志物方面已经有很多成功的应用。
　　在本研究中，我们首次应用人蛋白质芯片对MDS患者血浆中相对于正常对照组异常表达的蛋白质进行较为全面的检测。我们检测了64个MDS样本，其中包括28名tMDS患者和36名sMDS患者，还检测了13个转白(AML post-MDS)样本，正常对照样本为34个，共111个血浆样本。所有样本均通过与包含有9483个人类蛋白质的芯片杂交而进行检测。所得的数据通过应用ProCAT算法和quantile校正进行芯片内部和芯片之间的校正和标准化。然后再对数据进行非参数假设检验，得出了相对于正常对照组有显著差异的蛋白质/蛋白质组(p<0.01)。sMDS组有36个反应性显著增高的蛋白，其中4个也出现于tMDS中(如ARL8，PLK1)，2个还出现于AML/MDS中（如FGF16）；在tMDS组有8个反应性显著增高的蛋白质，其中4个也出现于sMDS中，2个可见于AML/MDS中(如LGALS1); AML/MDS组有5个反应性增高较为显著的蛋白质，其中与sMDS和tMDS表现重合的各为2个。例如，在tMDS组，DLEU（抑癌因子，促进细胞凋亡，抑制细胞增殖）和ARL8（ADP糖基化因子样蛋白8，促进细胞增殖）具有较高的显著性；在sMDS组中可见AKT3(丝/苏氨酸蛋白激酶家族成员，促增殖因子)和BAG1（原癌基因BCL-2的分子伴侣，具有抗凋亡作用）显著升高；而在AML/MDS中有FGF16（成纤维细胞生长因子16，促增殖因子）表现为显著升高。
　　这些蛋白质参与体内许多生物过程，如细胞凋亡、细胞间信号转导等等。一些高表达的蛋白质中有一部分与cDNA芯片的结果一致（如AKT3和FGF16）。而且，这些蛋白标志物与IPSS评分也显示出很高的相关性。我们的实践表明蛋白质芯片技术是MDS肿瘤血浆标志物研究的有力工具，在研究中我们筛选出MDS患者血浆中一些潜在的肿瘤标志物及疾病进展相关标志物。这对于促进MDS患者的临床诊断和预后判断具有积极地意义。
　　第二部分、单纯Sq-/伴5q-异常MDS患者RPS14表达水平及其与造血细胞凋亡关系
　　目的：探讨Sq-核型异常的骨髓增生异常综合征(MDS)患者核糖体蛋白(RP) S14的表达水平及与骨髓造血细胞凋亡的关系。
　　方法：采用实时定量PCR方法检测18例单纯5q-异常（7例）或Sq-伴有其他染色体异常（11例）MDS患者RPS14、MDM2、p53的mRNA表达水平，同时采用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶(APAAP)方法检测患者骨髓有核细胞p53蛋白表达，并同步采用TdT介导的dUTP缺口末端（荧光）标记（TUNEL）法检测骨髓细胞凋亡，10例正常人作为对照。
　　结果：15/18例(83.3％)伴有5q-异常患者骨髓细胞RPS14表达降低，其中6/7例单纯5q-异常患者表达降低，9/11例5q-伴其他核型异常患者表达降低；RPS14表达与MDM2、p53表达水平均呈正相关，而p53表达与骨髓细胞凋亡呈负相关。
　　结论：Sq-/5q-伴其他核型异常患者RPS14表达下降，并可能通过MDM2降低p53表达导致骨髓造血细胞过度凋亡。
　　第三部分、IGF-IR作为骨髓增生异常综合征骨髓克隆细胞相关标志物的研究
　　目的：胰岛素样生长因子I型受体(IGF-IR)具有促进细胞增殖和分化，抑制细胞凋亡的功能，在多种肿瘤的发生发展中起重要作用。我们既往的研究发现IGF-IR在MDS骨髓有核细胞表达明显增高，在高危组MDS的表达增高更为明显。为了进一步研究IGF-IR在MDS骨髓造血干细胞中的表达状况及其与MDS预后的关系；以及探索IGF-IR对MDS骨髓克隆细胞的标志性作用，我们设计了本课题。
　　方法：1．在扩大病例的同时通过流式细胞术(FCM)检测IGF-IR在MDS患者骨髓CD34+细胞中的表达状况；2．应用免疫磁珠法对MDS患者骨髓单个核细胞进行红系分选，对分选出的不含红细胞的单个核细胞进行FISH检测从而观察去红后单个核细胞IGF-IR表达与克隆细胞的相关性；3．应用FCM进行IGF-IR阳性细胞分选，通过对阳性细胞的FISH检测进行克隆细胞纯化实验，从而进一步证实IGF-IR在克隆细胞中的特异性表达及其对克隆细胞的纯化效率。
　　结果：1．IGF-IR在MDS患者骨髓CD34+细胞中高表达，其中IPSS评分低危／中危．1(IPSS≤1)组和中危-2/高危组(IPSS≥1.5)患者的IGF-IR表达具有显著差异(p<0.05，p=0.0128)，提示IGF-IR在MDS疾病预后判断中的意义；2．去红处理后的MDS骨髓单个核细胞恶性克隆比例显著增高，表明去除红系干扰后IGF-IR表达与克隆细胞相关性更高；3．IGF-IR+分选后的骨髓克隆细胞百分比显著升高，表明IGF-IR对骨髓克隆细胞具有显著的富集作用，提示IGF-IR可作为MDS克隆细胞潜在的纯化标志。