GSK3β抑制剂AR79促进前列腺肿瘤生长

摘要

目前研究已证实Wnt可促进骨的合成代谢，应用Wnt治疗骨合成代谢相关疾病的研究已成为目前该领域研究的热点。糖原合成酶激酶是Wnt信号通路中的重要组成部分，抑制其活性可进一步增加Wnt信号通路中β-catenin的表达，从而促进Wnt信号的传导，因此，GSK3β抑制剂AR79可通过活化Wnt通路来促进骨合成，并作为未来治疗骨质疏松等疾病的临床药物被研究和开发，但潜在的问题是AR79在活化Wnt信号通路的同时是否也会促进肿瘤的生长。
　　首先，我们通过不同浓度AR79对前列腺肿瘤细胞系(C4-2B，DU145和PC3)和成骨细胞系（ST2和MC3T3-E1）进行处理后，使用蛋白印迹的方法检测Wnt信号通路下游β-catenin，磷酸化β-catenin，以及细胞核中β-catenin水平的变化，利用Microarray检测经AR79处理后的前列腺肿瘤细胞以及骨细胞中Wnt靶基因的变化。同时，我们还利用细胞共培养BLI检测，Caspase-3/7Assay，Wound Healing Assay，Invasion Assay以及Soft-Agar Assay来进一步明确AR79在体外对前列腺肿瘤生物学特性的影响。体外实验结果表明:AR79促进了共培养体系中前列腺肿瘤细胞的生长，并可通过抑制β-catenin的磷酸化，增加了β-catenin在细胞核内的累积来活化Wnt信号通路。AR79可上调Wnt靶基因，增加前列腺肿瘤细胞迁移，侵袭以及克隆形成的能力。
　　此外，我们通过建立动物模型来研究AR79是否会影响前列腺肿瘤(PCa)在软组织和骨中的生长。将C4-2B-luc和DU145-luc两种前列腺肿瘤细胞分别注射到NOD/SCID小鼠皮下，然后口服给予不同剂量AR79和空白对照处理。结果表明，AR79可以促进前列腺肿瘤细胞在皮下软组织中的生长。骨骼是前列腺肿瘤最常见的转移灶，因此，我们通过前列腺肿瘤骨转移动物模型来研究AR79是否像促进皮下肿瘤一样，通过活化Wnt信号通路促进前列腺肿瘤在骨骼中的生长，因此，我们将C4-2B-luc细胞注射到NOD/SCID小鼠的一侧胫骨，然后口服给予不同剂量AR79和空白对照治疗。实验结果显示AR79可以促进前列腺肿瘤在骨中生长，放射学结果也显示随着肿瘤生长，胫骨的破坏逐渐加剧。为进一步明确AR79对肿瘤引起的骨质变化的影响，我们利用双能X线骨密度仪(DEXA)测量双侧胫骨骨密度(BMD)和骨量(BMC)，结果表明AR79虽然对有肿瘤骨转移侧的胫骨骨密度无影响，但却明显降低了骨量，这进一步说明AR79可以促进肿瘤在骨中生长，继而引起骨破坏。与此相反，AR79增加了无肿瘤骨转移侧胫骨的骨密度和骨量。肿瘤组织免疫印迹结果显示，AR79增加细胞内β-catenin的水平，减少了β-catenin的磷酸化。此外，肿瘤组织免疫组化分析结果显示AR79治疗组中肿瘤组织的Ki67表达增加，Caspase3表达降低，在Wnt信号通路中起关键作用的β-catenin在细胞核内的表达增加，因此，AR79在体内主要通过促进细胞增殖和减少凋亡来刺激肿瘤的生长。细胞核中β-catenin的表达增加也进一步证实了AR79是通过活化Wnt信号通路从而促进肿瘤的生长。
　　为进一步明确AR79促进前列腺肿瘤细胞生长的机理，我们利用Flow cytometry方法检测经不同浓度AR79处理后的前列腺肿瘤细胞ALDH及CD133的表达活性，同时进行前列腺肿瘤细胞的Spheroid Culture，实验结果表明，AR79增强了前列腺肿瘤干细胞表达的比例，促进tumorsphere的形成。
　　本研究结果表明GSK3β抑制剂AR79通过活化Wnt信号通路促进骨合成代谢的同时，也促进了前列腺肿瘤细胞的生长。因此，通过活化Wnt信号通路来促进骨代谢的治疗策略仍需更为深入的研究。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状和成果

研究目的和方法

一、AR79在体外对前列腺肿瘤细胞的影响

1．1 对象和方法

1．1．1 细胞培养

1．1．2 主要试剂及配置

1．1．3 主要仪器

1．1．4 生物发光成像(BLI)分析

1．1．5 Caspase-3／7检测

1．1．6 免疫印迹(Western Blot)

1．1．7 细胞总RNA的提取

1．1．8 逆转录合成cDNA

1．1．9 实时定量PCR

1．1．10 Microarray

1．1．11 TOPflash Luciferase检测

1．1．12 Soft-Agar实验

1．1．13 划痕实验(Wound Healing Assay)

1．1．14 侵袭实验(Invasion Assay)

1．1．15 统计学分析

1．2 结果

1．2．1 AR79促进前列腺肿瘤细胞的生长

1．2．2 AR79在体外对前列腺肿瘤细胞凋亡无影响

1．2．3 AR79抑制前列腺肿瘤细胞和骨细胞中β-catenin的磷酸化，增加β-catenin表达，并促进其向细胞核转移

1．2．4 AR79促进TCF／LEF reporter的活性

1．2．5 AR79上调Wnt靶基因

1．2．6 AR79促进前列腺肿瘤细胞克隆形成

1．2．7 AR79促进前列腺肿瘤细胞的迁移

1．2．8 AR79促进前列腺肿瘤细胞的侵袭

1．3 讨论

1．3．1 Wnt信号通路

1．3．2 Wnt与肿瘤

1．3．3 GSK3β及其调控

1．3．4 GSK3抑制剂的相关研究及应用

1．4 小结

二、AR79在体内对前列腺肿瘤及骨生长的作用

2．1 对象和方法

2．1．1 细胞培养

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要试剂配制

2．1．4 主要仪器

2．1．5 动物模型

2．1．6 AR79的制备，贮存及口服应用

2．1．7 TRACP 5b和骨钙素(Osteocalcin)检测

2．1．8 免疫印迹(Western Blot)

2．1．9 免疫组织化学染色(IHC)

2．1．10 Masson’s Trichrome染色

2．1．11 生物发光成像(BLI)分析

2．1．12 双能X线骨密度(DEXA)分析

2．1．13 放射学分析

2．1．14 统计学分析

2．2 结果

2．2．1 AR79促进前列腺肿瘤细胞在软组织中的生长

2．2．2 AR79增加前列腺肿瘤皮下肿瘤组织中β-catenin，降低磷酸化β-catenin的表达

2．2．3 AR79促进前列腺肿瘤细胞在骨中的生长

2．2．4 AR79增加皮下及骨中肿瘤组织Ki67，降低Caspase 3，促进细胞核中β-catenin的表达

2．2．5 AR79影响骨形成以及肿瘤诱导的骨破坏

2．3 讨论

2．3．1 GSK3β抑制剂通过启动Wnt信号通路促进骨合成代谢

2．3．2 GSK3β抑制剂在体内对肿瘤的影响

2．4 小结

三、AR79对前列腺肿瘤干细胞表达的影响

3．1 对象和方法

3．1．1 细胞培养

3．1．2 主要试剂及配置

3．1．3 主要仪器

3．1．4 细胞分离、染色和流式细胞分析

3．1．5 Tumorsphere形成实验

3．1．6 统计学分析

3．2 结果

3．2．1 AR79促进前列腺肿瘤细胞高表达ALDH以及CD133

3．2．2 AR79促进前列腺肿瘤细胞Tumorsphere的形成

3．3 讨论

3．3．1 前列腺肿瘤干细胞在肿瘤发生发展中的作用

3．2．2 Wnt信号通路在前列腺肿瘤干细胞中的作用

3．4 小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述

致谢