乳腺癌基因组表达谱中miRNA的血清学差异性表达分析

摘要

背景与目的：
　　 miRNA具有较好的组织特异性，在不同肿瘤中具有特定的表达模式，在乳腺癌、肝癌、肺癌、肠癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中得到了证实。肿瘤组织中的miRNA表达谱与肿瘤发生及预后相关，但是检测技术复杂、创伤大，且必须在手术之后才能获得标本，难以真正应用于临床。相比较而言，外周血血清较易获得和检测，临床应用便捷，利于推广，血清miRNA一经发现，便引起了研究者的极大兴趣。血清miRNA作为肿瘤标志物的研究仍存在许多问题，如血清miRNA所发挥的生物学功能尚未明确，血清和组织miRNA水平的相关性仍存在争议等。本研究旨在探讨乳腺癌患者血清miRNA的表达水平与乳腺癌组织内miRNA的表达情况是否一致，并进一步阐明血清miRNA作为乳腺癌诊断、治疗的生物学标志物的可行性和临床应用价值。本研究对上述问题的阐明，将有助于加快血清miRNA作为肿瘤生物标志物向临床转化的应用进程，为肿瘤早期诊断、判断生物学行为及预后评估提供新思路。
　　 方法：
　　 利用miRNA芯片对8对乳腺癌组织及配对的癌旁组织中miRNA表达谱进行分析，并利用实时荧光定量RT-PCR对芯片结果进行验证，筛选出差异性表达的目的miRNA。另选取天津医科大学附属肿瘤医院2011年3-10月经病理诊断明确的乳腺癌患者165例，同时选取我院体检的健康女性120例为对照组，采用实时定量聚合酶链反应(real-time RT-PCR)测定血清中目的miRNA相对表达量。
　　 结果：
　　 1.利用miRNA芯片对8对乳腺癌组织及配对的癌旁组织中924种miRNA表达情况进行分析，共筛选出23种差异性表达的miRNA，其中hsa-miR-155和hsa-miR-193b表达上调，hsa-miR-145、hsa-miR-381、hsa-miR-132、hsa-miR-206、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-100、hsa-miR-335、hsa-miR-497、hsa-miR-99a、hsa-miR-10b、hsa-miR-125b、hsa-let-7b、hsa-miR-10a、hsa-miR-126、hsa-miR-30a、hsa-miR-143、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-19b、hsa-miR-26a、rno-miR-324-3p表达下调，hsa-miR-10b在有淋巴结转移的乳腺癌组织中表达上调，而在无淋巴结转移的乳腺癌组织中表达下调。
　　 2.用miRNA real time RT-PCR对芯片筛查的结果进行验证，共筛选出10种差异性表达的miRNA，其中，hsa-miR-155和hsa-miR-193b表达上调，hsa-miR-100、hsa-miR-206、hsa-miR-381、hsa-miR-132、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-497和hsa-miR-99a表达下调，miRNA-10b在有淋巴结转移的乳腺癌组织中表达上调，而在无淋巴结转移的乳腺癌组织中表达下调。以差异表达量大于2倍，RT-PCR中CT值小于30作为标准，共筛选出4种miRNA，即miR-10b、miR-100、miR-155以及miR-206进行下一步的血清学表达分析。
　　 3.本研究共对165例乳腺癌患者和120例健康对照组血清中目标miRNA表达情况进行了定量分析，结果表明miRNA在血清中稳定表达。
　　 4.对照组与乳腺癌组miR-100、miR-155及miR-206相对表达量比较，差异均有统计学意义(P＜0.05);两组miR-10b相对表达量比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。乳腺癌患者血清中4种目标miRNA的表达情况与前期乳腺癌组织中的表达情况一致。
　　 5.miR-10b、miR-155和miR-206的表达与乳腺癌某些临床病理特征相关，其中miR-10b与淋巴结状态相关，无淋巴结转移组miR-10b的表达水平低于正常对照组(P=0.001)，而淋巴结转移组miR-10b的表达量显著高于正常对照和无淋巴结转移组(P=0.001，0.001)。miR-206的表达水平在不同分子分型间存在差异(P=0.040)，miR-206的表达与雌激素受体状态相关，在ER阳性组中miR-206的下调更加显著(P=0.035)。miR-155的表达与临床分期(P=0.001)、Ki-67(P=0.001)、突变型P53(P=0.027)相关，临床分期晚、Ki-67高表达、突变型P53阳性组miR-155上调更加显著。
　　 结论：
　　 1.通过miRNA组织芯片初步筛选以及real time RT-PCR验证，本研究共发现10种miRNA在乳腺癌组织及相应的癌旁组织中存在显著性差异，初步建立了乳腺癌特异性的miRNA差异表达谱，为miRNA在乳腺癌发生发展中作用机制的深入阐明奠定了基础，为乳腺癌诊断提供了新的潜在的生物学标志物。
　　 2.研究显示，血清miRNA的表达模式与乳腺癌组织存在良好的一致性，因此血清可以作为乳腺癌相关miRNA研究的标本来源，相对于组织来讲更具有临床应用价值。
　　 3.血清miRNA-10b和miRNA-206可以分别用来早期预测乳腺癌患者淋巴结转移状态和雌激素受体状态，miRNA-155可以早期判断乳腺癌细胞的恶性程度、预测临床分期及判断预后。
　　 4.血清miRNA可以成为乳腺癌潜在早期诊断、预测生物学行为、判断预后的非侵入性的新型生物标志物。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、乳腺癌组织差异性miRNA的筛选

1．1 对象和方法

1．1．1 标本来源

1．1．2 主要仪器设备

1．1．3 主要实验试剂

1．1．4 组织标本总RNA的提取

1．1．5 总RNA中miRNA的分离提取

1．1．6 miRNA芯片筛选

1．1．7 miRNA芯片结果real time RT-PCR验证

1．1．8 统计学分析

1．2 结果

1．2．1 miRNA基因芯片筛选结果

1．2．2 miRNA基因芯片筛选结果的real time RT-PCR验证

1．3 讨论

1．3．1 miRNA与肿瘤

1．3．2 乳腺癌差异性miRNA表达谱

1．4 小结

二、乳腺癌组织中差异性miRNA的血清学分析

2．1 对象和方法

2．1．1 标本来源

2．1．2 血清样本采集及处理

2．1．3 主要仪器设备

2．1．4 主要实验试剂

2．1．5 引物设计

2．1．6 实验方法

2．1．7 统计学分析

2．2 结果

2．2．1 血清目标miRNA的teal time RT-PCR检测

2．2．2 目标miRNA在前期乳腺癌组织芯片筛查中的表达情况

2．2．3 乳腺癌患者及对照组血清中目标miRNA表达情况

2．2．4 乳腺癌患者血清中miRNA相对表达量与乳腺癌临床病例特征间的关系

2．3 讨论

2．3．1 乳腺癌组织中差异性miRNA的血清学表达

2．3．2 血清miRNA与乳腺癌患者临床病理特征间的关系

2．4 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 循环miRNA与肿瘤研究进展

致谢