钙网织蛋白在类风湿关节炎患者体内表达上调及其对血管内皮细胞迁移作用的影响的研究

摘要

目的：
　　 类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种以慢性、进行性、侵袭性关节炎为主要表现，以周身关节滑膜炎及血管翳形成为主要病理特征的全身性自身免疫性疾病。其发病机制尚不是十分清楚，有研究报道钙网织蛋白(Calreticulin，CRT)可能参与了RA的病理机制。本研究采用多种免疫学方法分析CRT在RA患者血清、滑液以及滑膜中的表达情况，进一步分析CRT在RA发病机制中的潜在作用;鉴于NO作为RA发病过程中发生炎症反应和血管新生的主要参与者，本研究通过体外实验探讨CRT如何通过NO参与RA发病机制中的作用。
　　 方法：
　　 1.本研究选取标本全部选自2010年2月至2011年10月天津医科大学总医院感染免疫科和天津医院关节外科中心，血清标本:活动期RA44例;骨性关节炎(OA)16例;系统性红斑狼疮患者(SLE)25例;其他自身免疫性疾病24例，包括:干燥综合征11例，强直性脊柱炎5例，系统性硬皮病4例，血清阴性脊柱关节病2例，银屑病性关节炎和软骨炎各1例;同时选取性别、年龄相匹配的30名健康体检者作为健康对照。关节滑膜和滑液标本:RA7例，OA14例。
　　 2.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测RA、OA、SLE、其他自身免疫性疾病及健康对照血清中CRT含量;同时检测RA、OA关节滑液中的CRT含量。
　　 3.采用蛋白免疫印迹(Western blot)方法鉴定血清中CRT的存在形式。
　　 4.病理学方法检测关节滑膜组织中CRT的表达。
　　 5.采用人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)体外培养，检测CRT对NO产生的影响。
　　 6.MTT实验检测CRT对HUVECs增殖的作用。
　　 7.划痕实验分析CRT对HUVECs迁移的作用。
　　 数据均采用SPSS16.0软件包进行数据管理和统计分析。计量资料以(x)±s表示，数据为正态分布，采用单因素方差分析和Student-Newman-Kenls检验进行统计分析。检验水准为双侧α=0.05。
　　 结果：
　　 1.RA患者类风湿因子(RF)为（88.0±61.4）IU/ML;C反应蛋白(CRP)（5.7±6.0）mg/dl;血沉(ESR)（43.1±18.2）mm/h。OA患者RF（12.7±7.8）IU/ML;CRP（3.6±2.5）mg/dl; ESR（26.5±27.0）mm/h。系统性红斑狼疮(SLE)患者RF(52.9±34.6)IU/ML; CRP(5.6±5.5)mg/dl; ESR(42.7±16.3)mm/h。其他自身免疫性疾病对照组患者RF(40.5±25.9) IU/ML; CRP（5.5±6.0）mg/dl; ESR（42.2±11.1）mm/h。健康对照组CRP（0.6±0.5）mg/dl; ESR(12.3±13.4) mm/h。RA组与其他各组在年龄及性别构成等方面均无统计学差异(P＞0.05)。
　　 2.RA组血清中CRT含量[(4.817±2.423)ng/ml]高于OA组[(3.574±0.923)ng/ml]、SLE组[(4.013±1.524)ng/ml]、其他自身免疫性疾病组[(3.882±0.842)ng/ml]以及健康对照组[(3.726±0.619) ng/ml]，差异有统计学意义，p＜0.05。RA组与OA组滑液中CRT含量无统计学差异。2.Western blot结果显示，CRT在血清中仅见单体一种形式。RA组积分光密度值明显高于健康对照、OA、和SLE组(P＜0.05)。Western blot检测结果与ELISA一致，即CRT在RA血清中的表达明显增高。
　　 3.病理学结果显示RA滑膜组织中可见大量炎性细胞浸润，CRT呈现高表达，主要位于滑膜组织的衬里层和衬里下层、血管内皮细胞以及血管周围;在OA，CRT仅在衬里层及血管周围有极少量的表达。
　　 4.HUVECs在含有TNF-α的高糖DMEM培养后，内皮细胞分泌NO的水平较对照组明显升高。实验得出20ng/ml的TNF-α即为有效刺激HUVECs产生NO分泌的浓度。在10％胎牛血清完全高糖DMEM培养液加入不同浓度CRT培养24h后，NO的释放水平较对照组均有显著增高，且NO的分泌量随CRT浓度的改变呈现剂量依赖性。
　　 5.MTT实验显示，CRT对HUVECs的增殖没有明显作用;划痕实验证实CRT可以促进HUVECs迁移和创伤愈合的作用，NO在HUVECs迁移过程中发挥了重要的作用。
　　 结论：
　　 1.RA血清中CRT的含量显著增高。RA滑液中CRT含量增高，但与对照相比无统计学意义。
　　 2.CRT在血清中仅存在单体一种形式。
　　 3.CRT在滑膜组织中呈高表达，且表达位置不同于OA。提示CRT可能参与了RA的关节炎症反应及血管翳的形成。
　　 4.CRT可刺激NO的产生，且呈剂量依赖性，进而促进炎症反应。
　　 5.CRT可通过刺激NO的释放进而促进HUVECs迁移和创伤愈合，即CRT促进血管翳形成。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、钙网织蛋白在类风湿关节炎患者体内表达上调及其意义

1．1 对象和方法

1．1．1 研究对象

1．1．2 试剂与仪器

1．1．3 实验方法

1．1．4 统计学分析

1．2 结果

1．2．1 CRT在血清中的含量

1．2．2 CRT在滑液中的含量

1．2．3 CRT在血清中的存在形式及表达

1．2．4 CRT在滑膜组织中的表达

1．3 讨论

1．3．1 研究现状

1．3．2 血清及滑液CRT含量的分析及CRT存在形式

1．3．3 滑膜组织中CRT表达的分析

1．4 小结

二、CRT对血管内皮细胞迁移作用及其分子机制

2．1 对象和方法

2．1．1 研究对象

2．1．2 试剂与仪器

2．1．3 实验方法

2．1．4 统计学分析

2．2 结果

2．2．1 HUVECs细胞形态观察

2．2．2 TNF-α对内皮细胞分泌NO的影响

2．2．3 CRT对内皮细胞释放NO的影响

2．2．4 MTT实验分析HUVECs增殖

2．2．5 划痕实验分析HUVECs迁移

2．3 讨论

2．3．1 研究现状

2．3．2 CRT刺激血管内皮细胞释放NO的作用及CRT促进炎症反应的机理

2．3．3 CRT在HUVECs细胞增殖和细胞迁移中的作用

2．3．4 CRT与NO在RA发病机制中潜在作用的探讨

2．4 小结

结论

参考文献

发表论文情况说明

综述 钙网织蛋白及其在类风湿关节炎发病机制中的意义

致谢