H2O2及碘过量对MT-Ⅰ/ⅡKO小鼠脾脏的影响

摘要

一、H2O2对MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠脾脏的影响
　　 目的：脑缺血再灌注早期，脾脏中有大量炎症介质浸润，导致脑缺血再灌注后脾细胞出现大量凋亡，严重影响脑缺血再灌注病人的预后。用H2O2诱导WT小鼠及MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠脾细胞和线粒体，并观察抗氧化剂NAC和SOD抑制剂DETC对其的干预作用。探讨外源性H2O2对小鼠脾细胞活力的影响及NAC、DETC、MFⅠ/Ⅱ对H2O2诱导的脾细胞氧化应激损伤的作用，为保护脑缺血再灌注后脾细胞免受氧化应激损伤寻求新的思路。
　　 方法：
　　 1.制备WT小鼠及MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠脾细胞悬液，将细胞分为不同浓度H2O2(0，0.1，0.2，0.5，1，2mM)处理组，2h后MTT比色法检测细胞活力;
　　 2.荧光探针MitoSOX对不同浓度H2O2(0，0.1，0.2，0.5，1，2mM)处理2h的脾细胞进行染色，在荧光显微镜下对比观察各浓度组荧光强度;
　　 3.在细胞水平上，用0.5mM H2O2诱导WT小鼠及MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠脾细胞，并分别用NAC、DETC作干预处理，2h后MTT比色法检测细胞活力;
　　 4.分别检测NAC、DETC处理的0.5mM H2O2诱导的WT小鼠及MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠脾细胞培养液上清LDH的活力;
　　 5.NAC、DETC处理0.5mMH2O2诱导的WT小鼠及MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠脾细胞2h后，用荧光探针MitoSOX进行染色，在荧光显微镜下对比观察各组荧光强度;
　　 6.在线粒体水平上，分别用NAC、DETC处理0.5mM H2O2诱导的脾细胞线粒体，通过紫外分光光度仪检测线粒体的肿胀情况。
　　 结果：
　　 1.无论在WT小鼠还是MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠，随H2O2浓度增加脾细胞活力呈明显下降趋势(p＜0.05);但与WT小鼠相比，相同处理下MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠脾细胞活力下降程度更加明显(p＜0.05);
　　 2.无论在WT小鼠还是MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠，均随H2O2浓度增加MitoSOX平均荧光强度逐渐增强;但与WT小鼠相比，相同处理下MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠脾细胞MitoSOX平均荧光强度更强;
　　 3.同组间与各自对照组相比，0.5mM H2O2组脾细胞活力明显下降(p＜0.05)，LDH活力明显增加(p＜0.05)，MitoSOX平均荧光强度增强;与0.5mM H2O2组相比，NAC+0.5mM H2O2组细胞活力是升高的(p＜0.05)，LDH活力是降低的(p＜0.05)，且MitoSOX平均荧光强度是减弱的;MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠0.5mMH2O2组和NAC+0.5mM H2O2组分别与WT小鼠0.5mM H2O2组和NAC+0.5mM H2O2组相比，脾细胞活力是降低的(p＜0.05)，LDH活力是增加的（p＜0.05），MitoSOX平均荧光强度是增强的。
　　 4.同组间与各自对照组相比，0.5mM H2O2组线粒体吸光度值减小(p＜0.05)，提示线粒体肿胀增加;与0.5mM H2O2组相比，NAC+0.5mM H2O2组线粒体吸光度值增加(p＜0.05); MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠0.5mM H2O2组和NAC+0.5mM H2O2组分别与WT小鼠0.5mM H2O2组和NAC+0.5mM H2O2组相比，线粒体吸光度值无明显差别(p＞0.05)。
　　 5.同组间与各自对照组相比，0.5mM H2O2组、DETC组脾细胞活力降低(p＜0.05)，LDH活力增加（p＜0.05），MitoSOX平均荧光强度增强;与0.5mMH2O2组相比，DETC+0.5mM H2O2组脾细胞活力下降明显(p＜0.05)、LDH活力增加(p＜0.05)，MitoSOX平均荧光强度增强; MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠0.5mMH2O2组、DETC+0.5mM H2O2组和DETC组分别与WT小鼠0.5mMH2O2组、DETC+0.5mM H2O2组和DETC组相比，脾细胞活力下降(p＜0.05)，LDH活力增加(p＜0.05)，MitoSOX平均荧光强度增强。
　　 6.同组间与各自对照组相比，0.5mM H2O2组线粒体吸光度值明显减少(p＜0.05)，DETC组线粒体吸光度值无统计学差异(p＞0.05);与0.5mM H2O2组相比，DETC+0.5mM H2O2组线粒体吸光度值无统计学差异(p＞0.05);MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠0.5mM H2O2组、DETC+0.5mM H2O2组和DETC组分别与WT小鼠0.5mM H2O2组、DETC+0.5mM H2O2组和DETC组相比，线粒体吸光度值无统计学差异(p＞0.05)。
　　 结论：
　　 1.MT-Ⅰ/Ⅱ具有一定的保护作用。
　　 2.NAC能改善H2O2诱导的小鼠脾细胞氧化应激损伤。
　　 3.DETC加重H2O2诱导的脾细胞氧化应激损伤。
　　 二、碘过量对MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠脾脏的影响
　　 目的：观察摄入过量碘对MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠外周免疫器官脾脏的影响，探讨内分泌免疫系统与MT-Ⅰ/Ⅱ的内在联系。
　　 方法：
　　 随机选取成熟健康MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠和WT小鼠各20只，分别分为对照组和100KI组两组，每组各10只，喂养14天后用于实验。实验前称量小鼠体重，断颈处死后取脾脏称量重量，观察脾脏大小并计算脏体比;做脾脏冰冻切片，用于HE染色，观察脾脏结构的变化。
　　 结果：
　　 与对照组相比，100KI组脾脏体比和大小减小（p＜0.05），可能出现了体液免疫应答;与WT小鼠相比，MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠脾脏脏体比和大小减小更加明显(p＜0.05)，可能也出现了体液免疫反应但是也可见空洞样损伤。
　　 结论：
　　 过量碘使外周免疫器官脾脏减小，可能出现了体液免疫反应。在MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠脾脏体积减小更加显著，可能也出现了体液免疫反应但可见空洞样损伤，说明MT-Ⅰ/Ⅱ在碘过量引起的脾脏损伤方面具有一定的保护作用。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

一、H2O2对MT-Ⅰ／ⅡKO小鼠脾脏的影响

研究现状、成果

研究目的、方法

二、碘过量对MT-Ⅰ／ⅡKO小鼠脾脏的影响

研究现状、成果

研究目的、方法

一、H2O2对MT-Ⅰ /ⅡKO小鼠脾脏的影响

实验一 不同浓度H2O2对MT-Ⅰ／ⅡKO小鼠脾细胞活力的影响

1．1 对象和方法

1．2 结果

1．3 讨论

1．4 小结

实验二 抗氧化剂NAC对MT-Ⅰ／ⅡKO小鼠脾细胞氧化应激损伤的影响

2．1 对象和方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 小结

实验三 SOD抑制剂DETC对MT-Ⅰ／ⅡKO小鼠脾细胞氧化应激损伤的影响

3．1 对象和方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 小结

二、碘过量对MT-Ⅰ／ⅡKO小鼠脾脏的影响

1 对象和方法

1．1 实验动物的来源、饲养及繁育

1．2 主要仪器

1．3 主要试剂

1．4 主要溶液的配制

1．5 动物模型的建立及分组

1．6 取材和标本的准备

1．7 HE化学染色

1．8 统计方法

2 结果

2．1 脾脏的脏体比

2．2 HE染色结果

3 讨论

4 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述 金属硫蛋白在多器官中的抗氧化作用

致谢