移植血培养内皮祖细胞改善脑损伤小鼠神经功能的研究

摘要

背景：
　　 颅脑创伤对于人体健康危害极大，是现代社会致死率及致残率极高的疾病之一，尤其是对于年龄小于45岁的中青年人群。创伤后的一系列复杂病理生理学变化导致微循环障碍，血脑屏障通透性增高，神经元死亡，以及神经功能障碍。对于脑创伤的研究注重于伤后脑血流、脑代谢、脑水肿、颅高压、电解质平衡以及脑组织形态学改变的研究。尽管对于颅脑创伤后的病理生理学机制的研究有了很大发展，但是对于颅脑创伤的治疗方法还是较为局限，主要基于伤后的对症支持治疗。越来越多的学者意识到促进脑创伤区域血循环的恢复，对于大脑神经功能的恢复起到至关重要的作用。已有研究表明内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)可以促进血管新生，并已在多种体内研究中证实具有血管生成及促进损伤恢复的作用。血培养内皮祖细胞又称为内皮集落形成细胞(Endothelial colony-forming cells，ECFCs)是EPCs的同源亚型，具有更强的细胞增殖潜能并且表达更多的血管内皮生长因子受体。ECFCs移植治疗是当前研究的热点。
　　 目的:
　　 在颅脑创伤小鼠模型中证实循环血中内皮祖细胞在创伤急性期可以归巢定位于脑创伤区域，并探索移植血培养内皮祖细胞对创伤后神经功能的影响，为临床治疗颅脑创伤提供新的治疗策略。
　　 方法:
　　 应用梯度离心法分离新鲜脐静脉血提取单个核细胞(MNCs)，将所获得的MNCs采用贴壁培养的方法获取血培养EPCs(ECFCs)集落，并在体外培养、扩增，采用细胞免疫荧光法检测所获ECFCs的细胞表面标记。
　　 应用液压打击设备制备颅脑损伤免疫缺陷小鼠模型并将其随机分为三组，包括ECFCs移植组，PBS注射组和单纯打击组，将培养ECFCs由尾静脉注射入小鼠体内。应用性别错配实验，即将所获来源于男性胎儿脐带血的ECFCs由尾静脉移植入创伤后雌性小鼠体内，采用人Y染色体特异性探针并利用荧光原位杂交技术技术检测移植ECFCs的归巢。
　　 应用免疫组化和Western blot的方法检测小鼠创伤脑组织区域的微血管密度以及细胞因子表达的变化，分析血管新生与神经生物学功能恢复的关系。
　　 应用改良神经功能评分(mNSS)和Morris水迷宫分别评价移植ECFCs后神经行为学功能恢复和空间学习功能改善。
　　 结果:
　　 人脐血源的ECFCs移植后24小时在小鼠损伤脑组织部位被检测到，mNSS评分以及水迷宫实验证明移植ECFCs组神经功能损害较PBS注射组和单纯打击组有明显减少(P＜0.05)，同时移植组脑损伤侧的微血管密度(MVD)明显增加，细胞因子SDF1和VEGF表达较其他两对照组明显增高(P＜0.05)。微血管密度与mNSS评分呈负相关。
　　 结论:
　　 脐血源的ECFCs作为标志证明了循环血中EPCs能够归巢到脑损伤区域，移植ECFCs能够有效促进神经及血管的修复，并且改善了TBI后长期的神经功能，ECFCs移植未来可能是治疗脑外伤潜在的细胞治疗方法。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、内皮集落形成细胞的分离、培养、鉴定

1．1 材料和方法

1．1．1 实验材料

1．1．2 主要试剂和耗材

1．1．3 主要仪器和设备

1．1．4 主要试剂、液体的配制

1．1．5 试验方法

1．1．6 统计学方法

1．2 结果

1．2．1 ECFCs生长特性及形态学描述

1．2．2 ECFCs的鉴定

1．3 讨论

1．4 小结

二、ECFCs的归巢及对于颅脑创伤小鼠神经功能恢复的影响

2．1 对象和方法

2．1．1 动物和材料

2．1．2 小鼠液压打击模型的制作

2．1．3 实验动物分组与治疗

2．1．4 脑组织灌注与采集

2．1．5 组织学染色

2．1．6 改良神经功能评分(mMSS)

2．1．7 Morris水迷宫实验

2．1．8 统计学分析

2．2 结果

2．2．1 ECFCs归巢于脑创伤区域

2．2．2 mNSS评分的结果

2．2．3 Morris水迷宫的实验结果

2．3 讨论

2．4 小结

三、创伤区细胞因子VEGF、SDF-1及微血管密度变化

3．1 对象和方法

3．1．1 主要实验试剂和实验设备

3．1．2 小鼠液压打击模型的制作

3．1．3 实验动物分组与干预

3．1．4 脑组织灌注与采集

3．1．5 免疫印迹(Western blot)检测

3．1．6 组织学染色

3．1．8 微血管计数

3．1．8 统计学分析

3．2 结果

3．2．1 移植ECFCs后创伤区VEGF和SDF-1蛋白表达结果

3．2．2 移植ECFCs后对创伤区脑组织血管新生的影响

3．3 讨论

3．4 小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 内皮祖细胞的重新认识

致谢