内皮祖细胞移植改善大鼠肝移植缺血再灌注损伤的研究

摘要

目的：成功提取SD大鼠骨髓单个核细胞，体外培养并诱导其分化为血管内皮祖细胞(EPCs)；成功鉴定及染色EPCs，用以干细胞移植实验；成功建立大鼠原位肝移植(OLT)模型，观察对发生肝移植缺血再灌注损伤(IRI)的大鼠移植EPCs后，内皮祖细胞是否在大鼠肝血窦内发生归巢并观察EPCs移植对肝移植后IRI相关指标的影响。
　　方法：从同种SD大鼠股骨及胫骨骨髓中采用Percoll密度梯度离心法提取单个核细胞，二次贴壁后以选择性DMEM培养液诱导其分化，观察其形态学改变，对其进行免疫细胞化学染色鉴定和双荧光染色鉴定，并以红色荧光染料PKH26GL标记；将48只SD大鼠随机分为2组，采用改良Kamada袖套法建立大鼠原位肝移植模型，分组为OLT+EPC移植组12对和OLT对照组12对，EPC组肝移植受体大鼠关腹后经尾静脉输注EPCs，对照组经尾静脉输注生理盐水；两组均于术后6小时，24小时，48小时取血液标本及肝组织标本，冰冻切片荧光观察EPCs归巢情况，免疫组化观察肝血管区的EPCs抗原表达；检测肝功能ALT及血清TNF-α水平，HE观察肝组织病理损伤并评分。
　　结果：成功提取大鼠单个核细胞并诱导培养为EPCs，形态学观察，免疫细胞化学染色和双荧光染色鉴定其为EPCs：在3个时间点中EPC组可用荧光显微镜观察到EPCs在肝血窦中的归巢，免疫组化可观察肝血管区有EPCs抗原阳性表达；在3个时间点中，EPC组较对照组肝脏损伤较轻，肝功能改善明显，血清中炎症因子表达较低，具有统计学意义(p<0.05)。
　　结论：密度梯度离心法提取骨髓单个核细胞后，取二次贴壁细胞分化培养可以获得用以移植的足够数量和纯度的EPCs；EPC移植后可在损伤肝脏中归巢，从而增加血管新生，修复损伤肝血窦，改善微循环，抑制细胞凋亡，缓解组织炎症，最终改善肝移植术后的缺血再灌注损伤。