KLF2在内膜增生组织中的表达及作用机制研究

摘要

目的:
　　建立大鼠主动脉球囊损伤动物模型，观察主动脉球囊损伤后内膜增生的发生、发展情况，检测转录因子KLF2在损伤主动脉内膜增生组织中的表达及变化，并以腺病毒为载体将KLF2转染至血管平滑肌细胞，观察其对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响。
　　方法:
　　1.雄性SD大鼠80只，随机均分为8组，每组10只，其中7组为球囊损伤法建立主动脉损伤模型组（损伤组）;1组为接受假手术组（对照组），仅行开腹手术。分别在术后12小时、1天、3天、1周、2周、4周、8周取材;测量内膜面积和中膜面积并计算内膜面积/中膜面积，评估主动脉损伤后内膜增生程度;免疫组织化学法检测转录因子KLF2蛋白水平的表达，IPP6.0软件测定阳性染色平均光密度作为评价指标。
　　2.通过RT-PCR检测损伤主动脉内膜增生组织中转录因子KLF2在mRNA水平的表达及其变化。以GAPDH表达作为内参，KLF2/GAPDH作为转录因子KLF2的相对表达量。
　　3.颈离断法处死SD大鼠，每次取材5只，采用组织块贴壁法原代培养大鼠主动脉VSMCs并纯化鉴定，携带转录因子KLF2的腺病毒载体以最佳感染复数体外转染VSMCs。通过CCK-8和趋化小室检测方法观察KLF2转染的VSMCs细胞增殖和迁移能力的变化。
　　结果:
　　1.主动脉球囊损伤后1周可见明显新生内膜形成，不同时间点内膜增生程度以IA/MA表示，主动脉损伤后1周时IA/MA为0.175±0.048，损伤后2周时IA/MA为0.384±0.119，损伤后4周时IA/MA为0.558±0.213，损伤后8周时IA/MA为0.409±0.177。不难发现，主动脉损伤后1周时出现增生内膜组织，4周时内膜增生最明显，此后呈消退趋势。损伤后2周、4周、8周时内膜增生度比1周时明显，差异有统计学意义(P＜0.05);4周时内膜增生度与2周、8周时比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　2.免疫组化染色检测主动脉损伤血管组织，可见转录因子KLF2在损伤动脉增生内膜组织有阳性表达。通过IPP6.0测定中膜和内膜阳性染色平均光密度，损伤后1周时，中膜IOD/AA为0.072±0.022，内膜IOD/AA为0.421±0.015，损伤后2周时，中膜IOD/AA为0.079±0.029，内膜IOD/AA为0.788±0.040，损伤后4周时，中膜IOD/AA为0.069±0.018，内膜IOD/AA为1.115±0.019，损伤后8周时，中膜IOD/AA为0.061±0.031，内膜IOD/AA为0.708±0.036。可见损伤后4周时内膜增生组织中KLF2阳性表达最强，此后KLF2阳性表达强度逐渐减退。内膜增生度变化曲线和增生内膜中KLF2阳性表达曲线随时间变化呈现相似变化趋势。
　　3.RT-PCR结果:对照组中KLF2/GAPDH为0.6894±0.04689，可见KLF2基础水平表达，损伤后1周时KLF2/GAPDH为2.5112±0.2655，显示高于基础水平表达，损伤后4周时KLF2/GAPDH为12.8550±0.5465，显示表达达高峰，此后表达呈降低趋势，损伤后8周时KLF2/GAPDH为3.0565±0.2565，但表达仍高于基础水平。KLF2在损伤后1周、2周、4周、8周时内膜增生组织中的KLF2/GAPDH与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.001)。内膜增生度与KLF2相对表达量两者之间具有统计学意义的相关（r=0.70，P=0.001）。
　　4.采用组织块贴壁法原代培养大鼠VSMCs生长良好，4～8代时VSMCs纯度大于90％。Ad5-KLF2转染VSMCs后检测KLF2细胞免疫化学表达，表达率随转染时间延长逐渐增加，高水平的表达可持续14d以上。腺病毒Ad5-KLF2转染培养的大鼠VSMCs，可使KLF2在VSMCs中高效表达，并具有生物学活性。转染后VSMCs可显著促进其增殖和迁移。
　　结论:
　　大鼠主动脉球囊损伤动物模型中，主动脉损伤后1周时出现内膜增生组织，4周时内膜增生最明显，此后呈消退趋势;转录因子KLF2在主动脉内膜增生组织中表达阳性，4周时阳性表达最强，内膜增生度变化曲线和增生内膜组织中KLF2阳性表达曲线随时间变化呈相似变化趋势;腺病毒Ad5-KLF2转染培养的大鼠VSMCs可促进其迁移和增殖。这些研究表明转录因子KLF2参与内膜增生的形成，并可能通过调节平滑肌细胞迁移和增殖参与内膜增生与再狭窄的发生发展过程。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

第一部分 免疫组织化学染色法检测大鼠主动脉球囊损伤模型组织中KLF2蛋白表达

1．1 对象和方法

1．1．1 实验动物

1．1．2 主要实验仪器与设备

1．1．3 主要试剂

1．1．4 大鼠主动脉球囊损伤模型建立

1．1．5 标本取材

1．1．6 连续薄层切片

1．1．7 免疫组织化学染色(EnVision二步法)

1．1．8 图像采集及检测

1．1．9 统计学分析

1．2 结果

1．2．1 损伤主动脉形态学改变

1．2．2 KLF2蛋白质水平检测结果

1．3 讨论

1．3．1 大鼠主动脉球囊损伤模型中损伤动脉组织的变化

1．3．2 大鼠主动脉球囊损伤动脉组织中转录因子KLF2的表达

1．4 小结

第二部分 实时定量PCR技术检测大鼠主动脉模型组织KLF2 mRNA的表达

2．1 对象和方法

2．1．1 实验动物

2．1．2 大鼠主动脉球囊损伤模型建立

2．1．3 标本取材

2．1．4 主要实验仪器

2．1．5 主要实验试剂

2．1．6 无RNA酶处理

2．1．7 组织总RNA提取(Trizol Reagent Method)

2．1．8 总RNA浓度的测定

2．1．9 总RNA完整性的测定

2．1．10 反转录合成eDNA

2．1．11 设计KLF2引物

2．1．12 RT-PCR法测定KLF2的表达

2．1．13 统计学分析

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 小结

第三部分 KLF2调节平滑肌细胞增殖和迁移的体外研究

3．1 对象和方法

3．1．1 实验动物

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要试剂配制

3．1．4 主要仪器

3．1．5 血管平滑肌细胞(VSMCs)的培养

3．1．6 血管平滑肌细胞(VSMCs)的鉴定

3．1．7 5型腺病毒对VSMCs细胞转染效率的测定

3．1．8 CCK-8法检测Ad5-KLF2对VSMCs增殖能力的影响

3．1．9 KLF2对VSMCs迁移能力变化的检测

3．2 结果

3．2．1 大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)培养和鉴定

3．2．2 Ad5-KLF2对血管平滑肌细胞增殖能力的影响

3．2．3 Ad5-KLF2转染对VSMCs迁移能力变化的影响

3．3 讨论

3．3．1 VSMCs的培养、鉴定及转染

3．3．2 CCK-8法检测KLF2促平滑肌细胞增殖能力

3．3．3 趋化小室检测KLF2促平滑肌细胞迁移能力

3．4 小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述

致谢