应激状态下Tudor-SN蛋白的亚细胞定位与磷酸化分析

摘要

目的:Tudor-SN(Tudor Staphylococcal Nuclease)蛋白，又称为p100、SND1（staphylococcal nuclease domain containing1），广泛存在于人类、动植物中，可参与基因转录、细胞应激、pre-mRNA剪切等多种生物学过程。本课题组的前期研究结果表明当真核细胞受到外界刺激，如0.5mM亚砷酸钠氧化应激或45℃热休克时，Tudor-SN蛋白可以在细胞胞浆中形成颗粒状聚集，参与应激颗粒（Stress Granules，SGs）的构成。SGs是真核细胞受到氧化应激、热休克、病毒感染等各种环境刺激时在胞浆中产生的颗粒状结构，与mRNA代谢密切相关。本课题旨在深入探讨Tudor-SN蛋白的真核细胞应激生物学行为机制，主要关注应激状态下Tudor-SN蛋白的亚细胞定位与磷酸化分析。
　　方法:本课题实验分为三部分，第一部分主要利用细胞免疫荧光(immunofluorescence，IF)技术分析不同应激条件、不同细胞周期时相HeLa细胞内Tudor-SN颗粒的形成情况，以及Tudor-SN应激颗粒与细胞器、自噬颗粒的共定位关系;第二部分主要利用LI-COR Odyssey(R)近红外双色激光成像系统和传统的Western Blotting技术分析在0.5mM亚砷酸钠氧化应激或45℃热休克的应激条件时HeLa细胞内Tudor-SN蛋白的表达情况及其总体丝氨酸(Serine，Ser)、苏氨酸(Threonine，Thr)和酪氨酸(Tyrosine，Tyr)的磷酸化水平;第三部分主要是通过液相串联质谱（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry，LC-MS/MS）技术确定与0.5mM亚砷酸钠氧化应激相关的Tudor-SN蛋白磷酸化位点，进而合成相应的磷酸化多肽，免疫新西兰大白兔后收集血清获取抗Tudor-SN特定位点的磷酸化抗体，并进行应激磷酸化的相关分析。
　　结果:1）在给予细胞10mM DTT（二硫苏糖醇，Dithiothreitol）刺激时，Tudor-SN蛋白可在胞浆中形成应激颗粒，但当给予4℃冷处理1h、32℃冷处理20h以及20mM H2O2氧化应激1h、1μM毒胡萝卜素处理2h时均未发现Tudor-SN应激颗粒的形成;2）Tudor-SN蛋白应激颗粒并不与高尔基体、线粒体、内质网及自噬颗粒存在共定位关系;3）Tudor-SN蛋白应激颗粒在细胞周期的有丝分裂前期(Prophase)、前中期(Prometaphase)、中期(Metaphase)、后期(Anaphase)逐渐解聚消失，末期(Telophase)恢复;4）当细胞受到0.5mM亚砷酸钠氧化应激或45℃热休克处理时Tudor-SN蛋白表达水平没有变化，但总体Ser、Thr和Tyr的磷酸化水平升高;5）0.5mM亚砷酸钠氧化应激状态下Tudor-SN蛋白T73、T103位点可被磷酸化，并针对这两个位点制备兔源多克隆磷酸化抗体，包括抗pT73、抗pT103抗体;6）抗pT103抗体可以检测到细胞内Tudor-SN应激颗粒信号;7）HeLa细胞受到亚砷酸钠氧化应激及应激去除后恢复过程中，T103位点的磷酸化水平呈现一定的波动性时相。
　　结论:1）Tudor-SN蛋白参与细胞应激具有一定的应激条件依赖性，且随着细胞周期时相性发生变化;2)Tudor-SN应激颗粒在形态学上有别于细胞内高尔基体、线粒体、内质网及自噬颗粒结构;3）成功制备针对T73、T103位点的兔源多克隆Tudor-SN应激磷酸化抗体;4）当细胞受到应激时，Tudor-SN蛋白T103位点磷酸化水平非线性升高，参与细胞Tudor-SN应激颗粒的形成。

目录

声明

摘要

缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、Tudor-SN应激颗粒的亚细胞定位分析

1．1 对象和方法

1．1．1 细胞、菌种和质粒

1．1．2 主要试剂

1．1．3 主要溶液、缓冲液和培养基

1．1．4 主要仪器、设备

1．1．5 实验方法及流程

1．2 结果

1．2．1 在不同刺激条件下Tudor-SN应激颗粒形成实验

1．2．2 Tudor-SN颗粒与不同细胞器的共定位分析

1．2．3 Tudor-SN颗粒与自噬颗粒的共定位分析

1．2．4 Tudor-SN应激颗粒在细胞周期不同时相的定位分析

1．3 讨论

1．4 小结

二、Tudor-SN蛋白的应激磷酸化分析

2．1 对象和方法

2．1．1 细胞

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要溶液、缓冲液和培养基

2．1．4 主要仪器、设备

2．1．5 实验方法及流程

2．2 结果

2．2．1 细胞应激时Tudor-SN的蛋白表达水平

2．2．2 细胞应激时Tudor-SN蛋白的磷酸化水平

2．3 讨论

2．4 小结

三、Tudor-SN应激磷酸化抗体的制备与初步分析

3．1 对象和方法

3．1．1 细胞、动物和质粒

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要溶液、缓冲液和培养基

3．1．4 主要仪器、设备

3．1．5 实验方法及流程

3．2 结果

3．2．1 Tudor-SN蛋白应激磷酸化质谱分析

3．2．2 磷酸化多肽合成及分析

3．2．3 磷酸化抗体纯化

3．2．4 磷酸化抗体鉴定

3．2．5 pT103磷酸化抗体分析

3．3 讨论

3．4 小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 应激颗粒与临床疾病的相关性研究

致谢