短期高盐摄入诱导的Th17/Treg细胞免疫失衡与靶器官炎症反应的关系

摘要

研究目的:高盐(high salt，HS)饮食不仅是高血压的致病因素，还能独立于血压水平造成靶器官损伤。越来越多的证据显示免疫系统在高血压及其靶器官损伤发生中发挥重要作用，其中机体获得性免疫机制是引发靶器官炎症反应的关键因素之一。近来研究显示，辅助性T细胞17(T helper cell17，Th17)（生成白介素-17）和调节性T细胞(RegulatoryT cell，Treg)(表达转录因子FoxP3)各自发挥促炎和抗炎效应。Th17/Treg免疫平衡的调控是目前研究的热点。由Th17/Treg免疫失衡所致炎症紊乱，即免疫-炎症轴失衡参与了靶器官炎症反应和损伤。高盐摄入是否可通过影响人类Th17/Treg平衡进而引起靶器官的炎症反应尚未见报道。本研究旨在对健康志愿者中通过慢性盐负荷试验，观察在此期间外周血Th17/Treg免疫平衡的动态变化，并探讨其可能机制，以及与靶器官炎症反应的关系。
　　研究内容与方法:共纳入健康男性志愿者15人。平均26.93±0.92岁。
　　(1)按照世界卫生组织（World Health Organization，WHO）每日低于5g食盐（即NaCl）的摄入量作为低盐饮食标准。高盐饮食的标准确定为15g/日。由研究者按以上食盐摄入标准，给所有志愿者统一提供饮食并在同一地点就餐。整个饮食干预时间共17天，分为基线期（第1-3天，志愿者依据个人口味在同一地点自由进餐，共3天），随后紧接高盐期（第4-10天，共7天），最后进入低盐期（第11-17天，共7天）。
　　(2)每天测量并记录收缩压、舒张压和心率。于基线期第3天(day3，D3)，高盐第7天(day10，D10)，低盐期第7天(day17，D17)收集24小时尿，进行常规生化等检验。
　　分别在基线第3天(day3，D3)，高盐饮食第1天(day4，D4)、高盐饮食第2天(day5，D5)、高盐饮食第7天(day10，D10)、低盐饮食第7天(day17，D17)采集受试者外周血进行免疫细胞流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测，对CD4+和CD8+淋巴细胞亚群、B细胞(CD19)，以及Th17和Treg细胞表面分子抗体（CD4、CD25、IL-17和FoxP3）进行四色流式分析。对基线第3天(day3，D3)和高盐第2天(day4，D4)采集外周血使用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，通过基因芯片技术对其进行表达谱分析。使用TRIzol试剂裂解单个核细胞后，提取总RNA;采用聚合酶链反应(PCR)对表达谱分析确定的感兴趣差异基因进行mRNA水平的验证。
　　分别于基线第3天(day3，D3)，高盐饮食第1天(day4，D4)、高盐饮食第7天(day10，D10)、低盐饮食第1天(day11，D11)，低盐饮食第7天(day17，D17)采用飞利浦Intera3.0T全身磁共振系统对受试者腹部横断面T2WI扫描及冠状面高清BOLD-MRI扫描并计算肾髓质的表观-自旋弛豫率（R2*，R2*值与局部组织氧合水平呈正相关）。
　　分别于基线第3天(day3，D3)，高盐饮食第1天(day4，D4)、高盐饮食第7天(day10，D10)、低盐饮食第7天(day17，D17)通过无创超声评价肱动脉血流介导性的血管舒张(flow mediated dilation，FMD)。
　　结果:15名志愿者完成全部饮食干预及血液和尿液的有关检测，并根据24小时尿量、尿钠总量、尿肌酐总量以及血钠水平等指标进行质量控制并判定所得实验数据可靠。
　　(1)尿量、尿电解质和尿肌酐的变化:与基线期相比，高盐饮食期第7天24小时尿量（2241±615mL vs.1773±918mL）、尿钠（325.6±43.3mmolvs.152.9±52.1 mmol）、尿钾（38.9±8.9mmol vs.30.2±9.7mmol）均明显升高，且均有统计学差异（P均＜0.05）。与高盐饮食期第7天相比，低盐饮食期第7天尿量、尿Na+、尿K+显著降低且均有统计学意义(P均＜0.001)。高盐饮食期与基线期和低盐饮食期相比24小时尿肌酐显著升高（P均＜0.001）。
　　(2)血压、心率的变化:与基线期相比，高盐期收缩压和舒张压有上升趋势，低盐期呈现下降趋势，但变化无统计学意义(P＞0.05)，而心率在高盐饮食期明显增快(P＜0.01)，心率在低盐期较高盐期减慢(P＜0.05)。
　　(3)流式分析结果:CD3+、CD4+T细胞亚群及B淋巴细胞(CD19)均无明显变化(P＞0.05)。食盐摄入变化可导致Th17/Treg细胞比例发生变化，高盐第2天Th17细胞数量较基线水平下降(P＜0.05)，而Treg细胞数量较基线水平升高(P＜0.05)。而随着高盐摄入的持续，Th17细胞数量增加，而Treg细胞数量降低，至高盐第7天Th17/Treg比例较基线与低盐第7天均明显升高（P＜0.05）。
　　(4)基因芯片表达谱分析结果显示:与基线相比，高盐饮食第2天Th17相关信号通路表达下调(P＜0.01)，而Treg相关信号通路表达上调(P＜0.01)。相关基因SGK-1表达上调。
　　(5)表达谱芯片的PCR验证，即炎症因子IL-23和IL-8第一天时表达下降(P＜0.05)，Th17通路因子CD247表达下调(P＜0.05)，随后相关炎症因子如NFκB随高盐负荷加重表达逐渐升高(P＜0.05)。NFAT5在高盐第2天表达升高(P＜0.05)，SGK-1也表达升高(P＜0.05)。随着高盐负荷加重，炎症因子表达上调(P＜0.05)，而Treg相关抑制因子表达下降(P＜0.05)。
　　(6)肾髓质氧合水平的变化:肾髓质R2*值在高盐期同基线期比显著升高(P＜0.05)，且维持于相对稳定水平;增加的肾髓质R2*值在低盐期逐渐下降至基线水平，低盐第7天肾髓质R2*值同高盐期比显著下降(P＜0.05)。
　　(7)FMD结果表明:高盐饮食第1天FMD较基线期及高盐饮食第7天明显升高(P＜0.05)，至低盐期恢复至基线期水平，无明显差异(P＞0.05)。
　　结论:本研究首次证实高盐饮食能够引起健康志愿者循环中Th17/Treg免疫细胞比例和相关基因表达谱的变化，早期表现为Th17/Treg通路的下调，随高盐摄入的持续，Th17开始上调，同时上述效应可被低盐饮食所逆转。本研究为以Th17/Treg平衡失调为切入点的高盐摄入相关免疫学改变提供了新的人群研究证据。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、慢性盐负荷试验期间人外周血循环Th17／Treg平衡的动态变化

1．1 对象和方法

1．1．1 研究对象

1．1．2 基线调查和一般情况收集

1．1．3 试验分组及技术路线图

1．1．4 质量控制

1．1．5 血压和心率的测量方法

1．1．6 外周血B淋巴细胞亚群流式分析

1．1．7 外周血T淋巴细胞亚群分析

1．1．8 外周血Th17／Treg淋巴细胞分析

1．1．9 基因表达谱分析

1．1．10 淋巴细胞在高盐饮食前后基因表达谱变化的PCR验证

1．1．11 统计学分析

1．2 结果

1．2．1 一般资料

1．2．2 饮食盐干预对心率、血压的影响

1．2．3 饮食盐干预对尿量、尿钠、尿钾和尿肌酐的影响

1．2．4 饮食盐干预期间外周血Th17／Treg细胞的动态变化

1．2．5 基因表达谱分析

1．2．6 饮食盐摄入波动对炎症相关细胞因子表达水平的影响

1．3 讨论

1．3．1 T淋巴细胞亚群

1．3．2 效应T细胞在高血压发病中的作用

1．4 小结

二、短期高盐摄入对相关靶器官功能和炎症反应的影响

2．1 对象和方法

2．1．1 研究对象

2．1．2 肾脏组织氧合状态的检测

2．1．3 高频超声测定肱动脉的血管舒张功能

2．1．4 统计学方法

2．2 结果

2．2．1 短期高盐摄入对肾脏组织的影响

2．2．2 短期高盐摄入对血管内皮功能的影响

2．3 讨论

2．3．1 短期高盐摄入造成肾脏炎性损伤

2．3．2 短期高盐摄入造成血管内皮功能的改变

2．4 小结

全文结论

论文创新点

局限性

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 高血压相关免疫机制研究进展

致谢