重组CARDs TX蛋白的克隆、表达与纯化及多克隆抗体制备

摘要

目的:肺炎支原体作为非典型肺炎的病原体，不仅能够引起急、慢性呼吸道感染，还可以引起包括皮肤、关节、中枢神经系统等一系列肺外系统疾病。目前，肺炎支原体的致病机制仍未被阐明。近期，研究者们发现一种名为社区获得性呼吸窘迫综合征毒素(CARDs TX)蛋白，其被认为是目前为止，肺炎支原体体内单一的毒力因子，在肺炎支原体的致病过程中起到了至关重要的作用。本课题拟构建pET28α-CARDs TX重组质粒，观察其在BL21中表达，并对CARDsTX蛋白进行纯化，利用纯化CARDs TX蛋白免疫动物制备抗血清，并对抗血清的效价和特异性进行检测，探讨其应用价值。
　　方法:一、重组质粒的构建及鉴定:以肺炎支原体基因组为模板，利用PCR技术扩增出带有BamHⅠ和XholⅠ酶切位点的CARDs TX基因(MPN372)，将其克隆入pET28α，经8次点突变(UGA-UGG)获得pET28α-CARDs TX重组质粒。对重组质粒分别进行酶切与测序鉴定。
　　二、重组质粒的表达及鉴定:将重组质粒转入BL21中，利用IPTG诱导带有pET28α-CARDs TX重组质粒的BL21细菌表达目的蛋白，分别通过SDS-PAGE和Wetern Blot检测CARDs TX蛋白的表达并对目的蛋白可溶性进行鉴定。
　　三、CARDs TX蛋白的纯化及鉴定:利用亲和层析技术(Ni-NTA)对CARDsTX进行纯化，并通过SDS-PAGE和Wetern Blot方法鉴定目的蛋白纯化情况。
　　四、多克隆抗体的制备和鉴定:适应性饲养2只雄性大白兔2周后进行初次免疫，将1ml1mg/ml CARDs TX蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分混合，于大白兔皮下多点免疫。2周后，每隔1周用1ml1mg/ml蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合，进行多点加强免疫。初次免疫前采取大白兔耳缘静脉血为对照，末次免疫两周后颈动脉取血。利用Western blot方法检测其效价及特异性，ELISA法检测抗血清的应用价值。
　　结果:一、经酶切鉴定发现外源基因、载体及重组质粒均位于正确的大小位置。经测序鉴定，结果发现外源基因碱基序列与Genbank公布的MPN372碱基序列一致，且成功将8个UGA位点突变成UGG。
　　二、对SDS-PAGE和Wetern Blot结果进行分析，我们发现在IPTG的诱导后，在68 kDa的位置有蛋白量明显增多。同时也发现该蛋白为不可溶性蛋白。
　　三、利用亲和层析技术对目的蛋白进行纯化并对纯化蛋白进行SDS-PAGE和Wetern Blot分析，结果发现，在68 kDa的位置上有特异的目的条带。
　　四、成功制备特异、高效价的重组CARDs TX蛋白多克隆抗体，且在肺炎支原体的检测中有较好的应用价值，为对肺炎支原体的预防、诊断和治疗提供了依据。
　　结论:成功构建出pET28α-CARDs TX重组质粒。经IPTG诱导后，在BL21中CARDs TX蛋白的表达明显增加，并成功将CARDs TX蛋白纯化出来，并成功制备出高效价、特异的多克隆抗体。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、重组CARDs TX蛋白的克隆、表达与纯化

1．1 材料和方法

1．1．1 实验材料

1．1．2 实验方法

1．2 结果

1．2．1 pET28 α-CARDs TX重组质粒的构建

1．2．2 pET28 α-CARDs TX重组质粒的表达

1．2．3 重组CARDs TX蛋白的纯化

1．3 讨论

1．3．1 MPN 372基因引物设计和载体克隆

1．3．2 MPN 372基因的点突变

1．3．3 突变克隆的筛选

1．3．4 外源基因的表达体系

1．3．4 包涵体的形成与溶解

1．4 小结

二、重组CARDs TX蛋白多克隆抗体的制备

2．1 材料和方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．2 结果

2．2．1 Western-blot检测抗体特异性及效价

2．2．2 ELISA对抗体检测功能的评价

2．3 讨论

2．4 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述 肺炎支原体感染的研究进展

致谢