微流控和单细胞分选技术在生物医学中的应用研究

摘要

目的：近年来，随着微流控技术和二代测序技术的不断发展，微流控芯片在生物医学领域中的应用越来越广，而单细胞分析也引起了越来越多的关注。本文首先开发了一种用于体外抗高血压药物评估的仿真微流控芯片装置；其次，鉴于现有的分离单细胞技术的不足，建立一种鉴定、富集和挑选单细胞的系统。
　　方法：（1）①用软光刻技术以PDMS为材料制作出内部管道尺寸为长4 cm、宽2 mm、高100μm的PDMS-玻璃微流控芯片。芯片用FN在37℃包被1 h，在芯片上种入HUVECs并培养；②利用一个微流注射泵、一个注射器、一个数字压力计、接头和软管与芯片搭建为一套微流控芯片加压系统，通过微流注射泵设置流速，数字压力计显示压力，给芯片内培养的内皮细胞施加合适的压力；③实验时，在压力为0 KPa、12 KPa、18 KPa下，分别通入药物浓度分别为0，50，250，500μmo l/L的培养液，实验分两组：第一组加压时和加压后都对细胞给药，第二组只在加压后对细胞给药.微流控芯片放入培养箱中，加压系统其它部分则留在外面；④加压后收集加压过程和加压之后的培养液，做ELIS A用于检测ET-1释放，用鼠抗人CD62P抗体和羊抗鼠Alexa Fluor546二抗、Alexa Fluor488 phalloidin、DAPI对细胞进行染色，把芯片置于荧光显微镜下观察并拍照。（2）①计算机作为整个系统的控制中枢，三轴电缸作为384孔板液体自动分配器，显微操作仪控制毛细玻璃针的位置，显微注射泵控制细胞的吸吐，显微镜用于拍照和实时显示。②用C++编写程序控制系统各个部件，生成第一步384孔板和第二步玻璃微坑操作的图形用户界面；③为了实现单细胞的高效富集，用两个步骤实现富集和挑选功能：第一步，使用384孔板对样品进行初筛：样品经预处理后制备成细胞悬液，平均分配到384孔板中，显微镜下对孔板每个孔依次成像，用软件辅助判断目标细胞所在的孔，并将孔中所有细胞收集；第二步：将第一步收集的细胞平铺到玻璃微坑上，对整个细胞液滴进行成像，软件辅助判断目标细胞在液滴中所在位置，通过显微操作仪和显微注射泵控制玻璃针，将目标细胞吸入，并吐出细胞至载玻片上的油滴里；④为了检验系统挑细胞的效率，将转染了RFP荧光蛋白的乳腺癌细胞系MDA-MB-231掺入到乳腺癌细胞系MCF-7的掺杂样品作为实验样品。设置五组实验，分别将1个、2个、5个、10个和20个MDA-MB-231-RFP细胞掺入100万个MCF-7细胞中，每组实验重复5次。将小鼠肝癌肿瘤组织作为样品，经组织消化后制备成单细胞悬液，在系统上挑取单个肝癌细胞，用全基因组、转录组和单细胞甲基化方法对细胞进行扩增、建立文库并用Illumina Hiseq2500高通量测序平台进行测序。
　　结果：（1）①使用微流注射泵、电子压力计、微流控芯片、接头盒软管所搭建加压系统可用于研究内皮细胞对压力和药物的响应；②细胞Alexa Fluor488 phalloidin、DAPI染色结果表明压力越大，F-肌动蛋白细胞骨架被破坏，随着加入药物浓度的增加，F-肌动蛋白微丝重新排列；③细胞CD62P和DAPI染色结果表明压力增加，刺激细胞分泌P选择素，药物浓度增加，P选择素分泌减少；④ET-1检测实验表明，内皮细胞释放ET-1随着压力的增加而增加，随着药物浓度增加而减少。（2）①所搭建的挑细胞系统可在程序控制下正常工作；②384孔板和第二步玻璃微坑操作的图形用户界面可辅助实验图像识别，实验数据保存以及实时显示功能；③掺杂实验表明系统挑取单细胞效率可达60％以上；④小鼠肿瘤细胞样品实验表明系统可挑取组织消化后单细胞样品并成功用于全基因组、转录组和甲基化测序分析。
　　结论：（1）本论文所搭建的微流控芯片加压系统具有操作简单、成本低等优点，可成功用于抗高血压药物对受压力损伤后内皮细胞的修复作用的评估；（2）本论文提出了一种实现极少量细胞富集、挑取的方法，并搭建了实现此方法的半自动化系统，使用此系统成功实现了单细胞的挑取。

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缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、微流控芯片用于体外仿真降血压药物评估系统的研究

1 .1对象和方法

1 .2结果

1 .3讨论

1 .4小结

二、一种单细胞鉴定、富集和挑选系统的研究

2 .1对象和方法

2 .2结果

2 .3讨论

2 .4小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: 微流控芯片技术在循环肿瘤细胞分离中的研究进展

致谢