MDMX通过与p53蛋白的二次作用抑制p53DNA结合功能的分子机制

摘要

背景：
　　p53作为肿瘤抑癌蛋白，直接参与了细胞周期调控、细胞代谢、生长以及细胞凋亡、衰老等不同损伤或应激的反应过程。此过程中 p53蛋白具有两个重要的调节蛋白—MDM2和MDMX。其中，MDM2能够通过其C末端的E3连接酶降解p53蛋白。而MDMX蛋白虽然与MDM2的泛素E3连接酶序列同源，但是MDMX对p53蛋白的调节作用是具有唯一性的。通过纯化MDMX蛋白鉴定出的高亲和力分子伴侣—CK1α，可以和MDMX蛋白的中间区域相结合并促进MDMX-p53蛋白之间的相互作用。基于MDMX能够与p53蛋白在细胞核内共定位，并调节p53功能，本文拟探索MDMX对于p53蛋白的非降解性调节机制以及对于p53 DNA结合功能是否具有抑制作用，并在此过程中分子伴侣CK1α是否发挥了其协同作用。
　　方法：
　　1.DNA结合实验：首先将FLAG-MDMX或者CK1α-MDMX与p53复合物转染至 H1299肿瘤细胞系内，其次用 M2琼脂糖珠子纯化FLAG-MDMX/CK1α-MDMX-p53复合物，然后与含有p53结合位点的DNA片段相孵育，细胞体外证明是否FLAG-MDMX/MDMX-P53复合物与DNA片段相结合。
　　2.应用PONDR方法预测MDMX分子结构内部无序区域并选择酶切位点位置，插入三个不同的抗原表位标签（FLAG，MYC和HA），从而构建MDMXc3新的质粒用于下一步实验。
　　3.蛋白片段释放实验（Proteolytic fragment release，PFR）：将MDMXc3细胞过表达于H1299细胞系与GST-p53相孵育，然后用特异性抗体固定裂解的细胞内蛋白，用PreScission蛋白酶切除复合物后，如果蛋白片段相结合则被固定在琼脂糖珠子上，而没有结合的蛋白片段则释放到上清液中。应用这种新的实验技术，我们进一步研究了MDMX与p53分子间的相互作用以及CK1α能否协同促进MDMX与p53之间相互作用的分子机制。
　　4.细胞体内实验验证在敲除A549，JEG-3，MCF-7以及U2OS四个肿瘤细胞系内MDMX或者 CK1α，应用 Western blot以及染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation，CHIP)探查MDMX与CK1α能否协同抑制p21蛋白的表达以及p53与目的基因p21启动子的相互结合；进一步在IPTG诱导NARF细胞后稳定表达ARF以及在伽马放射线（IR）的作用下，肿瘤细胞内稳定表达p53蛋白及其目的蛋白 p21，应用 Western blot以及染色质免疫共沉淀技术检测MDMX或者 MDMX-367A是否能够抑制目的蛋白 p21；我们创建稳定表达MDMX以及 MDMX-367A的U2OS肿瘤细胞系，内源性敲除 CK1α后，应用Western blot以及染色质免疫共沉淀技术研究是否 CK1α参与了MDMX或者MDMX-367A抑制p53 DNA结合功能的分子机制。
　　结果：
　　1. DNA结合实验表明，CK1α-MDMX-p53三种蛋白复合物能够有效抑制p53蛋白的序列特异性DNA结合活性；MDMX-367A与CK1α相结合后也能够明显抑制p53蛋白与序列特异性DNA相结合，而289位点突变后的MDMX无法被CK1α磷酸化从而不能发挥抑制p53蛋白的DNA结合功能的作用。因此实验说明p53蛋白的DNA结合功能被抑制，需要MDMX和CK1α相互协作，以及CK1α对于MDMX289位点的磷酸化。
　　2.创建可酶切的MDMXc3质粒用于一种新的实验方法——蛋白片段释放实验，其结果表明在MDMX-p53复合物中，MDMX的p53结合域（N端）与p53 N端初始结合后，MDMX的酸性结构域和RING结构域能够二次结合到p53蛋白上并形成稳定的复合物，而MDMX的RING结构域与p53蛋白的结合强度明显高于其N端之间的相互结合。
　　3.蛋白片段释放实验的结果表明MDMXc3的酸性结构域与RING结构域稳定结合到 p53的核心结构域上。并进一步研究位于 MDMXc3的酸性结构域上的W200S/W201G突变体发现突变体的酸性结构域与p53蛋白的结合减弱，而RING结构域依然与p53蛋白结合力很强，说明酸性结构域与RING结构域是结合到p53蛋白核心结构域的不同位点上。
　　4.与CK1α-136N-MDMXc3-p53以及CK1α-MDMXc3-289A-p53两种三联复合物的阴性对照结果相比，蛋白片段实验结果说明CK1α能够促进MDMX的酸性结构域与p53蛋白的相互作用，并稳定两种蛋白之间的相互结合。进一步研究发现，MDMX的RING结构域不仅能够增加MDMX与p53蛋白之间相互作用的稳定性，而且可以使得p53蛋白活性失活。
　　5.四种不同肿瘤细胞系体内敲除 CK1α或者 MDMX，我们发现 MDMX或者CK1α缺失后都会增加p53目的蛋白p21的表达以及p53与目的基因p21启动子的结合，但是并不影响 p53蛋白的稳定性；NARF细胞被 IPTG诱导稳定表达ARF或者经过伽马放射线作用后，肿瘤细胞内部能够稳定p53及其目的蛋白p21的表达，在这个背景下转染野生型 MDMX或者突变型 MDMX-367A可以进一步抑制p21的表达以及p53与p21基因启动子的结合；我们敲除U2OS稳定表达MDMX或MDMX-367A细胞内源性CK1α之后，发现MDMX与p53之间的结合减弱。在伽马放射线诱导 p53目的蛋白 p21表达背景下，仍然敲除内源性CK1α，MDMX或MDMX-367A对p21的表达以及与p21基因启动子结合的抑制活性被部分反转，说明MDMX或MDMX-367A抑制p53蛋白活性需要CK1α的参与。
　　结论：
　　这些结果表明除了MDMX和p53的N端之间的经典特异结合以外，蛋白之间相互作用过程中出现了二次结合现象，而这个过程对成熟复合物的形成具有明显的稳定作用。CK1α与MDMX复合物通过进一步稳定MDMX酸性结构域与p53核心结构域的相互作用，从而协同抑制p53蛋白的DNA结合能力。这些结果也揭示了MDMX通过分子间二次结合作用调控p53蛋白功能的分子机制，并表现出多结构域蛋白复合物相互作用的共同特征。

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缩略语/符号说明

前言

一、细胞体外验证MDMX抑制p53 DNA结合功能

1.1对象和方法

1.1.1 主要材料及试剂

1.1.2 主要仪器设备

1.1.3 实验方法

1.2结果

1.2.1细胞体外证明MDMX和CK1α 协同抑制p53 DNA结合功能

1.2.2设计蛋白酶可切的MDMX分子结构

1.2.3蛋白片段释放实验探测MDMX分子内部结构

1.2.4 MDMX酸性结构域和RING结构域通过二次结合作用于p53蛋白

1.2.5 MDMX酸性结构域和RING结构域与p53核心结构域相互作用

1.2.6 MDMX RING结构域-p53之间的相互作用导致p53失活

1.3讨 论

1.4 小结

二、细胞体内验证MDMX与CK1α协同抑制p53 DNA结合功能

2.1对象和方法

2.1.1 主要材料及试剂：

2.1.2 主要仪器设备：

2.1.3. 实验方法

2.2 结果

2.2.1细胞体内验证MDMX和CK1α共同抑制p53 DNA结合功能

2.2.2 MDMX抑制ARF介导的p53表达活性

2.2.3 细胞体内MDMX抑制p53 DNA结合功能需要CK1α 的表达

2.3 讨论

2.4 小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:P53、MDMX与CK1α的相互作用及研究进展

致谢