天津市性活跃人群血清沙眼衣原体免疫优势蛋白抗体的检测

摘要

沙眼衣原体（ Chlamydia trachomatis C.t）是引发性传播疾病（ Sexually Transmitted Diseases STD）及泌尿生殖道感染性疾病的主要病原体。据WHO数据统计，世界范围内每年有约1.27亿沙眼衣原体感染新发病例。近年来，沙眼衣原体引发的泌尿生殖道感染在全球呈逐年增长态势，已居于性传播疾病的首位。流行病学调查显示，衣原体感染症状隐匿，通常不被发现或不被治疗，感染持续存在，最终可引起盆腔炎、异位妊娠、不孕以及男性前列腺炎等多种严重并发症。C.t感染生殖道后亦可协同人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus HPV）的感染并增加 HIV传播的危险性，且与宫颈鳞状细胞癌（ Squamous Cell Carcinoma SCC）发病率呈正相关。因此，早期开展C.t感染的筛查，尽早发现感染者和无症状带菌者并给予充分治疗，对C.t传播的防控具有重要意义。
　　然而我国现有的各种检测方法中存在取材痛苦、敏感性和特异性不高、结果判定有主观性等各种缺陷，从而不适于作为C.t的筛查手段。而国内现阶段大规模采用的C.t检测试剂盒所针对的抗原蛋白大部分是主外膜蛋白（Major outer membrane protein MOMP）、热休克蛋白60（Heat shock protein HSP-60）和脂多糖（Lipopolysaccharide Lps）这三种抗原。其中MOMP和HSP-60有较好的抗原性及特异性，但其抗原性排名均未在前20种免疫优势蛋白之列。Lps又缺乏特异性，易与其它病原体Lps抗体产生交叉反应而影响检测的准确性。
　　因此，为优化沙眼衣原体感染的实验室筛查方法，提高检测的敏感性和特异性，我们在以往研究的基础上，选取了Pgp3、CT694和CT875这3种C.t特异性免疫优势蛋白的组合，并收集了天津医科大学总医院非性病门诊15-40岁性活跃人群血清300例，运用酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA）检测血清中上述三种蛋白的抗体存在情况，同时对每一份血清样本均进行微量免疫荧光（Microimmunofluorescence MIF）检测，通过比对两种方法的检测结果，了解新建立ELISA方法的敏感性和特异性。
　　目的：表达3种C.t特异性的免疫优势蛋白：衣原体质粒编码蛋白3（Pgp3）、Ct875编码蛋白（CT875）、Ct694编码蛋白（CT694）。收集天津医科大学总医院非性病门诊性活跃人群血清共300份。ELISA法检测血清中上述三种蛋白抗体的存在情况，并与MIF法检测结果相比对，了解新建立ELISA方法的敏感性与特异性。
　　方法：将编码上述三种蛋白的基因重组质粒转化入大肠杆菌，琼脂糖凝胶电泳鉴定转化成功后，将菌液扩大培养，IPTG诱导表达，超声碎菌获得蛋白。表达成功的蛋白经GST Magbeads纯化，SDS电泳鉴定。收集天津医科大学总医院非性病门诊15-40岁就诊者血清共300例。用所得蛋白裂解液包被谷胱甘肽预包被的ELISA96孔板，饱和板底的谷胱甘肽，分别加入制备好的血清、鼠源性单克隆抗体作为一抗，HRP标记的羊抗人、羊抗鼠IgG作为二抗，运用ELISA方法检测各血清样本中三种蛋白的存在情况。制备衣原体EB抗原片，分别以与兔抗EB抗体和血清样本为I抗，FITC标记的羊抗兔IgG抗体和Cy3标记的羊抗人 IgG抗体为Ⅱ抗，MIF法检测血清抗体存在情况。比较两种方法的检测结果。
　　结果：1.三种蛋白重组质粒转化成功，蛋白成功表达。
　　2.ELISA结果：300例非性病门诊性活跃人群血清筛查结果如下：共筛出衣原体感染阳性者63例。沙眼衣原体感染总阳性率21％。其中15~20岁年龄组阳性者7例，阳性率21.88%；21~25岁年龄组阳性者9例，阳性率19.15%；26~30岁年龄组阳性者22例，阳性率25.88%；31~35岁年龄组阳性者17例，阳性率21.52%；36~40岁年龄组阳性者8例，阳性率14.04%。
　　3.MIF结果：共筛选出沙眼衣原体感染阳性者65例，阴性者235例。
　　4.两种检测方法比对结果：63例ELISA法阳性结果血清中，62例微量免疫荧光法结果阳性，1例阴性。237例ELISA阴性结果血清中，234例微量免疫荧光结果阴性，3例阳性。以MIF法为标准，3种免疫优势蛋白组合筛选检测的敏感度为95.38%（62/62+3），特异度为99.57%（234/234+1）。
　　结论：1.新建立ELISA方法对天津市性活跃人群沙眼衣原体Pgp3、CT875、CT694三种免疫优势蛋白抗体的总检出率为21%。
　　2.新建立的ELISA方法具有较高的敏感度与特异度，适合用于衣原体感染的初筛。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、沙眼衣原体免疫优势蛋白的表达

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、性活跃人群血清沙眼衣原体免疫优势蛋白抗体的检测

2.1对象和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

三、微量免疫荧光法对300例血清筛查结果的验证

3.1对象和方法

3.2实验结果

3.3讨论

3.4小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:沙眼衣原体检测方法研究进展

致谢

个人简历