膀胱癌患者尿液中外泌体及相关miRNAs的检测及临床意义

摘要

目的：
　　探讨差速超速离心法从膀胱癌患者尿液中提取外泌体（ exosome)及相关微小RNAs(microRNAs,miRNAs)的可行性。对exosome及miRNAs进行鉴定,分析其潜在的临床价值，为进一步在尿液中寻找膀胱癌诊断标记物做前期准备。
　　方法：
　　一、Exosome的差速超速离心提取
　　1.1尿液标本的获取。检索病例资料数据库，统计分析既往我院膀胱癌入院患者的数量及分布情况，说明该实验标本易得。选择可行的留取膀胱癌患者合格尿液标本的方案，制定留取策略，留取标本。
　　1.2差速超速离心。划分非肉眼血尿和肉眼血尿两个实验组。在留取的100 ml尿液中加入保护剂。4℃下进行离心操作。提前预冷离心机和转子。2000 g离心10分钟后去除大的细胞碎片；再17000 g离心45分钟，去除较小的碎片和较大的细胞外囊泡；然后200000 g离心70分钟，去除上清液；加入PBS重悬再次离心；最后用40μl去离子水溶解，-80℃冻存，或继续下一步实验。
　　二、Exosome的鉴定分析
　　2.1透射电子显微镜观察。取上步中离心提取的样品10μl，加入去离子水稀释后在超声振荡仪下将exosome分散开，取10μl稀释分散后的样品滴加在超薄碳膜铜网的碳膜面，1分钟后滤纸从铜网一侧吸去多余的样品，再滴加5μl多聚甲醛固定液，10分钟后吸去多余液体；然后滴加5μl PBS溶液，5分钟，重复三遍；再滴加5μl戊二醛固定液,10分钟后吸去多余液体；PBS溶液清洗三遍；最后滴加5μl磷钨酸染液。1分钟后，白炽灯下烤干后镜下观察。
　　2.2纳米微粒追踪分析(NTA)。开机，设置参数；取3μl离心提取物，加入约0.3 ml水中混匀；将混匀的液体注入，开始分析。
　　2.3免疫印迹实验。BCA法测定提取的exosome中蛋白浓度。配制所需试剂。将标本在95℃下加热5分钟变性。然后上样后进行120 V恒压下电泳。然后350 mA恒流下电转70分钟。将PVDF膜在5％封闭液中4℃摇晃过夜封闭。然后一抗室温孵育2小时，二抗室温孵育1小时。显影观察目的蛋白的表达情况。
　　三、miRNA的鉴定分析
　　3.1 miRNA的提取。应用miRNA提取试剂盒提取exosome中的miRNA，并测量其浓度。冷冻真空干燥法纯化miRNA。
　　3.2 qPCR分析。设置qPCR参数：解链温度94℃，时间2分钟；变性温度为94℃，时间20秒；退火温度设置为62℃，时间34秒。循环43次。
　　结果：
　　1、本院膀胱癌入院患者数量较多，签订知情同意书可提高留取合格尿液标本的成功率，为23/25。
　　2、差速超速离心法可稳定的从膀胱癌患者尿液中提取外泌体。
　　3、电镜、NTA和免疫印迹结果显示离心提取物中大量外泌体的存在，同时发现其中混杂有胞外囊泡。
　　4、通过qPCR检测到健康人尿液和膀胱癌患者尿液中15b-5p等miRNA具有显著性的差异。
　　结论：
　　1、本研究获取大量尿液标本的可行性高。
　　2、膀胱癌患者尿液离心提取物中含有大量exosome。
　　3、可以从exosome中提取出miRNA。
　　4、通过差速超速离心法提取膀胱癌患者尿液中exosome及miRNA可行、可靠。尿液将成为膀胱癌诊断生物标记物的良好来源。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、膀胱癌患者尿液中exosome的超速低温提取

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、Exosome的鉴定分析

2.1对象和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

三、Exosome中miRNA的相关分析

3.1对象和方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: 尿液exosome及相关microRNA在膀胱癌诊断中的意义

致谢

个人简历