骨髓干细胞介导的miR-451通过调控AMPK信号通路治疗胶质瘤的体内外研究

摘要

研究认为，胶质瘤的发生发展涉及多基因异常改变及其相关的信号转导通路异常。不同的通路之间形成严密的调控网络，共同调节着肿瘤细胞的一系列生理过程及多种机制异常的病理过程。
　　文献报道上百种miRNAs与胶质瘤的发生发展相关。其中miR-451位于染色体17q11.2，多种恶性肿瘤，如胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌等均发现有miR-451的异常表达。
　　前期研究发现手术切除的胶质瘤标本中，miR-451低表达，且病理级别越高，其表达越低。随后通过 Lipofectamine2000为载体，应用 miR-451mimics使胶质瘤细胞系中miR-451上调，并通过细胞周期检测、MTT、侵袭实验、凋亡实验等手段，验证了 miR-451的抑癌基因作用。并且进一步研究确定， CAB39为miR-451的靶基因，可通过LKB1（CAB39）- AMPK-PI3K-AKT通路来发挥抑癌基因的作用。但由于PI3K-AKT通路只是恶性肿瘤信号转导通路的一部分，也是多种信号通路的共有部分，miR-451是否可通过AMPK调控其它通路及其具体机制尚未完全明确。
　　恶性肿瘤快速增殖，会产生不同程度的缺氧，进而引起AMPK及HIF-1α的激活及表达，最终引起血管生成刺激因子VEGF表达升高，促进肿瘤新生血管生成、增殖及转移。多种恶性肿瘤均存在AMPK-HIF-1α通路的异常激活。文献报道：miR-23b作为癌基因在胶质母细胞瘤中高表达，下调miR-23b的表达可导致HIF-1a/VEGF通路受到抑制，而miR-451与miR-23b的作用正好相反，因此在胶质瘤中，是否可以通过 miR-451上调，从而抑制 AMPK-HIF-1α-VEGF通路，最终达到抑制肿瘤增殖、新生血管生成，降低肿瘤的侵袭性和复发，是此项研究关注并要解决的问题。
　　随着分子生物学进展，基因治疗在恶性胶质瘤的综合治疗中前景光明。而选取合适、高效的基因转运载体是要优先考虑的问题。以细胞为基础的治疗载体逐渐引起重视并成为有前景的抗肿瘤药物/基因传递系统。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）来源丰富、易于体外分离和培养、能向肿瘤趋向移动，可将治疗用的药物/基因运送至肿瘤内部，逐渐成为有应用前景的细胞治疗载体。
　　本课题拟应用人骨髓干细胞作为细胞载体携带 miR-451，转染至胶质瘤细胞，从而观察miR-451以CAB39为靶标，通过AMPK- HIF-1α-VEGF通路对胶质瘤的调控作用。研究共分为三部分。
　　第一部分是人骨髓干细胞（hBMSCs）的分离、培养、鉴定及其作为基因治疗载体的文献回顾研究。骨髓组织取自成年男性股骨干骨折手术患者，采用密度梯度离心结合贴壁筛选法进行hBMSCs的分离。hBMSCs获得后，常规传代培养3～5代可将各种非贴壁细胞和混杂细胞除去，从而建立高度纯化、性状稳定的hBMSCs细胞系。经流式细胞术进行鉴定，发现CD29、CD44、CD71抗原阳性，HLA-DR、CD34、CD45抗原阴性。随后进行体外分化能力诱导培养，发现细胞可向成脂及成骨分化，证实培养细胞为hBMSCs，符合实验要求。随后通过文献分析和总结，表明hBMSCs有良好的趋向肿瘤移动潜能，及可以作为细胞载体携带治疗所用基因及改造的细胞因子用于恶性胶质瘤的基因治疗。
　　第二部分在体外研究中，我们先以慢病毒为载体将miR-451转染至hBMSCs，并用 RT-PCR的方法检测被转染的 hBMSCs中 miR-451表达情况。随后取感染hBMSCs的上清液，与U87、U251、LN229人胶质瘤细胞系混合培养，上调肿瘤细胞中的 miR-451的表达，并用 RT-PCR的方法验证。我们将实验分为三个组：control组，hBMSCs组及LV-miR-451-hBMSCs组。分别应用MTT法、平板克隆形成实验、细胞周期分析、Transwell、划痕实验、Anexin V及 Western blot等方法检测肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡等能力，进一步验证 miR-451作为胶质瘤的抑癌基因。这些结果显示出hBMSCs良好的载体功能，以及miR-451以CAB39为靶标，对AMPK-HIF1α-VEGF通路的调控作用。
　　第三部分主要是通过制备裸鼠异源原位胶质瘤颅内模型进行体内实验。我们通过立体定向注射的方式，建立颅内胶质瘤模型。7天后，将实验小鼠随机化分为3组，施加不同的处理措施，主要分为：LV-miR-451-hBMSCs组，hBMSCs组及 control组，行活体成像，并给予治疗措施。观察三组裸鼠治疗期间体重变化、活体成像荧光强度，记录每只小鼠死亡的时间，描绘生存曲线，并用Kaplan-Meier法进行生存分析。将死亡裸鼠脑组织行H-E及免疫组化染色。结果显示，治疗组裸鼠体内荧光强度显著弱于后两组，且生存期显著长于其它两组。免疫组化提示治疗组中 AMPK-HIF-1α-VEGF通路中的成员 LKB1、AMPK、HIF-1α及VEGF在LV-miR-451-hBMSCs组中均表达下降。上述结果充分验证了胶质瘤中miR-451通过AMPK-HIF-1α-VEGF通路调控抑制胶质瘤的生物学行为。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

第一部分 人骨髓干细胞的分离、培养及其作为载体功能的文献回顾研究

1.1引言

1.2材料和方法

1.3结果

1.4讨论

1.5小结

第二部分 骨髓干细胞介导的miR-451通过调控AMPK信号通路治疗胶质瘤的体外研究

2.1 引言

2.2.材料及方法

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 小 结

第三部分 骨髓干细胞介导的miR-451通过调控AMPK信号通路治疗胶质瘤的体内研究

3.1 前 言

3.2 对象和方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 小 结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: 干细胞在脑胶质瘤治疗中的研究进展

致谢

个人简历