戊型肝炎规范化实验室诊断模式的建立

摘要

目的：1.系统评估我国主流HEV抗原/抗体ELISA检测试剂盒的诊断灵敏度、特异度及相互间结果符合度，形成可指导临床实验室应用的HEV血清学检测试剂盒的质量报告，以规范戊型肝炎的实验室诊断流程。2.设计出充分满足临床诊断灵敏度和特异度要求的能够检测HEV不同基因型病毒株的一步法荧光定量逆转录PCR（Real-timeRT-PCR）检测体系；并初步建立起HEV RNA考评血清盘和质粒标准品，用于评价HEV核酸检测的质量评估。3.建立起不依赖特殊设备和专业人员操作的快捷高效检测HEV RNA的逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)平台。
　　方法:1.收集戊肝患者、健康体检人群、风湿免疫病患者及巨细胞病毒(CMV)和EB病毒感染早期患者血清样本，分别用万泰、科华、贝尔、丽珠、新创HEV IgM和 IgG抗体检测试剂盒对上述标本进行平行检测，以考察不同试剂盒各自的诊断灵敏度和特异度及相互间的结果符合率。2.用 HEV细胞培养上清液作为中和抗原，通过中和抑制实验的方法来验证各HEV抗体检测试剂盒间检测结果不一致时是否为真阳性。3.在HEV ORF3高度保守区设计能检测HEV不同基因型病毒株的PCR引物和探针引物，建立起一步法(Real time RT-PCR)检测体系；将拟扩增的HEV RNA目的基因片段构建成质粒，以建立HEV质粒DNA标准品，用于浓度标准曲线的构建；构建HEV基因1-4型病毒株细胞培养体系，将培养上清液通过阴性血清倍比稀释的方式初步建立评价HEV RNA检测的考评血清盘。4.在HEV基因组保守区域内的6个位点区域设计4条特异性引物,建立起适用于不同基因型HEV RNA检测的一步法逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)；采集临床患者血清标本和猪、兔粪便标本分别用RT-LAMP方法、Real time RT-PCR及逆转录巢式PCR(RT-nPCR)方法进行并行检测，以验证RT-LAMP方法的有效性；用其它病毒性肝炎病原体来验证其特异性，通过阳性标本HEV RNA梯度倍比稀释的方式来验证其灵敏度。
　　结果:1.不同厂家HEV IgM抗体检测试剂盒检测结果具有良好的一致性，诊断灵敏度普遍欠佳，均未超过85％，特异度很好，未在非戊肝患者人群中发现HEV IgM抗体阳性现象。2.不同厂家HEV IgG抗体检测试剂盒在戊肝患者人群中检测结果具有较好的一致性，诊断灵敏度较高(90%以上)，在非戊肝患者人群中，检测结果有较大差异，以万泰和科华为例，万泰试剂盒在非戊肝患者人群中抗体阳性率在16.5%-31.9%之间，而科华阳性率仅为1.1%-3.3%之间。3.通过中和抑制试验未发现万泰检测试剂盒有假阳性现象，进一步说明了万泰IgG抗体试剂盒检测灵敏度较高，而其它几种试剂盒容易出现假阴性现象。4. HEV抗原检测试剂盒与IgM和IgG抗体检测结果及HEV RNA检测有很高的相关性，未发现IgM和IgG抗体均阴性而HEV抗原阳性的病例。5.本研究建立了能够高效扩增包含兔HEV病毒株在内的基因1-4型HEV病毒株的检测，适用于血清和粪便等标本，最低检测限可达25copies/test，较传统RT-nPCR灵敏度高10倍以上；在103和106 copies/μl两个浓度水平处，该方法批内和批间精密度分别低于2%和3%，具有很好的重复性；经临床标本验证分析发现能够用于戊肝患者及动物宿主的血清和粪便标本检测，且灵敏度显著高于RT-nPCR。6.本研究构建了HEV质粒标准品及HEV RNA考评血清盘，经稳定性验证评估，能够初步满足临床应用需求。7.本研究成功构建了适用于包含兔HEV在内基因1-4型HEV RNA RT-LAMP检测方法。该方法最低检测限度为5copies/test，显著优于RT-nPCR技术，略优于Real time RT-PCR技术。与HAV,HBV和HCV患者血清标本对无交叉反应，特异度良好。233份血清或粪便标本对该技术进行检测效能验证，并将该方法与Real time RT-PCR和RT-nPCR分别进行平行检测。结果显示RT-LAMP和Real time RT-PCR检测阳性率显著高于RT-nPCR，而两者间检测符合率高达92%，未发现Real time RT-PCR或RT-nPCR检测阳性而RT-LAMP检测阴性的标本。
　　结论：1.不同厂家HEV IgM抗体检测试剂盒之间的检测结果差异较小，对戊肝临床诊断的灵敏度均在80%以上，特异性较高。HEV IgG抗体检测试剂盒较 IgM检测试剂盒更灵敏，但诊断特异度在不同厂家之间差异较大，经综合比较发现科华IgG抗体检测试剂盒较适合于戊肝临床诊断检测，与IgM抗体检测试剂盒配伍使用，能很好地弥补其灵敏度不足，又能有效解决自身诊断特异度不足的问题。2.万泰IgG抗体试剂盒较其它3种厂家灵敏度最高，更加适合于流行病学调查，鉴于科华试剂盒较低的检测灵敏度，不适合应用于流行病学调查。3.HEV抗原检测试剂盒与HEV RNA检测有很好的相关性，虽然其出现最早，能有效缩短HEV感染的检测窗口期，但鉴于戊肝的发病特点，当患者有症状就医时抗体往往已经出现，因此HEV抗原检测在临床应用中的价值仍需进一步研究，本研究未发现其能提高HEV感染诊断效率的证据。4.本研究建立了能够高效扩增包含兔HEV病毒株在内的基因1-4型HEV病毒株的HEV RNA一步法Real time RT-PCR检测体系，适用于血清和粪便等标本的检测，具有检测灵敏度、特异性高，重复性好等特点，值得进一步优化后进行商品化尝试。5.本研究构建了Realtime RT-PCR所需的质粒标准品，该标准品易制备、易精确定量，储存条件简单，稳定性好。解决了HEV RNAReal time RT-PCR检测临床实验室推广应用的瓶颈。6.本研究初步制备了HEV RNA检测考评血清盘，对Real-time RT-PCR检测HEV RNA的临床推广所面临的标准化和结果可控可比的问题进行了初步探索。该血清盘目前针对我国HEV感染人群和动物宿主中主要基因型(基因4型)的特点而制备，未来仍需进一步完善丰富其覆盖的基因型别。7.本研究初步建立了RT-LAMP技术检测HEV RNA的新方法，在特异度、灵敏度和临床标本检测验证中表现出了良好效果。该方法不需要昂贵的设备和繁琐的电泳分析过程，能高效快速的检测出我国HEV各型主要基因型病毒株，有望成为医院临床实验室特别是HEV流行区基层医疗单位HEV核酸筛查检测的新方法。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、戊肝血清学诊断试剂盒的效能评价

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、规范化HEV RNA荧光定量PCR检测及考评体系的建立

2.1对象和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

三、RT-LAMP检测技术在HEV RNA检测中的应用

3.1对象和方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:我国戊型肝炎流行、诊断与防治的研究进展

致谢

个人简历