公开/公告号CN101085347A
专利类型发明专利
公开/公告日2007-12-12
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申请/专利权人 东南大学;
申请/专利号CN200710024412.9
申请日2007-06-15
分类号A61K39/29(20060101);A61K39/295(20060101);A61P1/16(20060101);A61P31/14(20060101);A61P31/20(20060101);
代理机构32200 南京经纬专利商标代理有限公司;
代理人陆志斌
地址 210096 江苏省南京市四牌楼2号
入库时间 2023-12-17 19:24:25
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2023-05-12
专利权质押合同登记的生效 IPC(主分类):A61K39/29 专利号:ZL2007100244129 登记号:Y2023980039148 登记生效日:20230425 出质人:滁州方舟药业有限公司 质权人:滁州银丰融资担保有限公司 发明名称:甲型肝炎-乙型肝炎-戊型肝炎联合疫苗 申请日:20070615 授权公告日:20100519
专利权质押合同登记的生效、变更及注销
2023-05-02
专利权质押合同登记的注销 IPC(主分类):A61K39/29 授权公告日:20100519 申请日:20070615 专利号:ZL2007100244129 登记号:Y2022980004613 出质人:滁州方舟药业有限公司 质权人:滁州银丰融资担保有限公司 解除日:20230414
专利权质押合同登记的生效、变更及注销
2022-05-10
专利权质押合同登记的生效 IPC(主分类):A61K39/29 专利号:ZL2007100244129 登记号:Y2022980004613 登记生效日:20220422 出质人:滁州方舟药业有限公司 质权人:滁州银丰融资担保有限公司 发明名称:甲型肝炎-乙型肝炎-戊型肝炎联合疫苗 申请日:20070615 授权公告日:20100519
专利权质押合同登记的生效、变更及注销
2010-05-19
授权
授权
2008-02-06
实质审查的生效
实质审查的生效
2007-12-12
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一、技术领域
本发明属一种联合疫苗及其制备方法，特别是涉及甲型肝炎-乙型肝炎-戊型肝炎联合疫苗及其制备方法。
二、背景技术
病毒性肝炎是由多种肝炎病毒引起的以肝脏损害为主的传染性疾病，在世界各地均有流行。甲型肝炎(甲肝)是由甲型肝炎病毒(HAV)引起的急性病毒性肝炎，主要通过粪-口途径传播。1988年上海因食用毛蚶导致甲肝急性大流行，出现30余万例甲肝病例；乙型肝炎(乙肝)是由乙型肝炎病毒(HBV)感染所致，广泛流行于世界各地，我国是乙肝的高流行区，乙肝除暴发性肝炎外主要危害在于感染后变为慢性病毒携带者，并进一步发展成为慢性肝炎甚至肝癌，危害十分严重，是我国公共卫生的一个重要问题；戊型肝炎(戊肝)是经粪-口途径传播的急性病毒性肝炎，由戊型肝炎病毒(HEV)感染所致。1986-1988年我国新疆发生戊肝大流行，是世界上最大的一次戊肝爆发性流行，12万余人受到感染。
甲肝疫苗以及乙肝疫苗已经上市多年，这两种疫苗的生产技术及应用已经非常成熟。戊肝疫苗则尚在研制中。HEV由于细胞培养非常困难，因此目前难以研制灭活疫苗或减毒活疫苗，国内外的研究大都集中于通过基因重组技术来研制基因工程亚单位疫苗。
含有两种或两种以上抗原、可以预防两种或两种以上疾病的联合疫苗的研究一直受到众多学者关注，并以其方便、多效、低成本成为新一代疫苗研究的热点。与单一疫苗相比，联合疫苗可以减少疫苗的接种次数，避免因漏种而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐热，其生产、运输、储存、销售乃至全部使用过程均需在较低温度下进行，即所谓的“冷链”，这种环环相扣的冷链运作，费用极高，使疫苗成本居高不下。而使用联合疫苗，则可以大大降低冷链运作的费用，因此具有显著的优越性。百日咳-白喉-破伤风三联疫苗在计划免疫中已使用多年即为一成功之例。近年来一些新的联合疫苗如甲肝和乙肝联合疫苗也已经获得专利(欧洲专利0339667)。但是，作为病毒性肝炎的甲型肝炎-乙型肝炎-戊型肝炎联合疫苗(HAV-HBV-HEV联合疫苗)的研制迄今为止在国内外尚未见报道。
三、发明内容
本发明提供一种方便、多效、低成本、并能够有效预防人及动物甲肝、乙肝、戊肝的HAV-HBV-HEV联合疫苗及其制备方法。
本发明技术解决方案为：一种HAV-HBV-HEV联合疫苗，包括灭活甲肝抗原以及重组乙肝抗原和重组戊肝抗原。其灭活HAV含量为200-1000U/mL，优选剂量为500U/mL；其重组HBsAg为10-40μg/mL，优选剂量为20μg/mL；其戊型重组肝炎病毒蛋白的含量为10-50μg/mL，优选剂量为20μg/mL。
制备方法为：在制备最终的HAV-HBV-HEV联合疫苗之前，将灭活HAV吸附于氢氧化铝凝胶，将重组HBsAg吸附于氢氧化铝凝胶，将重组HEV蛋白吸附于氢氧化铝凝胶，调整pH至5.5-9.6；将调整了pH的上述组份混合。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明的HAV-HBV-HEV联合疫苗可以有效的用于预防人和动物的甲肝、乙肝和戊肝。动物实验表明，与单价灭活甲肝疫苗、单价重组乙肝疫苗和单价重组戊肝疫苗相比，HAV-HBV-HEV联合疫苗能够明显增加重组HBsAg和重组HEV蛋白的免疫原性；而联合疫苗诱导的甲肝抗体水平与单价灭活甲肝疫苗无明显区别。因此本发明提供的联合疫苗具有单价疫苗同样甚至更好的免疫原性。
本发明的联合疫苗中使用了经充分证明具有良好安全性及免疫原性的灭活HAV和重组HBsAg。此外，以往的研究已经证实，本研究组制备的重组HEV蛋白同样具有良好的安全性和免疫原性，可以用于戊肝疫苗的研制。因此本发明的联合疫苗不仅在技术上可行，而且由于联合疫苗具有方便、多效、低成本的优点，所以本发明能够大大降低病毒性肝炎疫苗的生产成本和市场价格，提高疫苗的覆盖率。
四、具体实施方式
实施例中甲型肝炎-乙型肝炎-戊型肝炎联合疫苗以HAV-HBV-HEV联合疫苗表示。
实施例1
一种HAV-HBV-HEV联合疫苗，包括灭活甲肝抗原以及重组乙肝抗原和重组戊肝抗原。其灭活HAV含量为200-1000U/mL，优选剂量为500U/mL；其重组HBsAg为10-40μg/mL，优选剂量为20μg/mL；其戊型重组肝炎病毒蛋白的含量为10-50μg/mL，优选剂量为20μg/mL。
本实施例还包括免疫佐剂，该免疫佐剂为氢氧化铝凝胶溶液，氢氧化铝凝胶的浓度范围调整为0.6-1.5mg/mL，优选浓度为1.0mg/mL。
上述的灭活甲肝疫苗是HAV HM175株或其他可用疫苗株经纯化灭活制备。
重组HBsAg是由酵母细胞，哺乳动物细胞，或其他可用细胞表达的基因工程重组蛋白，其特征在于包括HBV的任何HBsAg或其片断，其优选的序列为HBsAg S抗原的226个氨基酸序列(见Tiollais等，Nature，317，489(1985))。
重组HEV蛋白的氨基末端位于HEV开放阅读框架2编码的380位至480位氨基酸之间，其羧基末端位于580位至650位氨基酸之间或由此氨基酸产生的衍生物，其所述的序列为：
RGIALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQ
QDKGIAIPHDIDLGESRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSL
TAAEYDQTTYGSSTNPMYVSDTVTFVNVATGAQGVSRSLDWSKVTLDGRPLM
TIQQYSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVCIS
TYTTNLGSGPVSISAVGVLAPHSALAALEDTVDYPARAHTFDDFCPECRALGLQ
优先选用第453位至631位氨基酸序列(p179)。其所述的序列如下：
VIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQTTYGSSTNPMYVSDTVTFVNVATGAQGVSRSLDWSKVTLDGRPLTTIQQYSKTFYVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVCISTYTTNLGSGPVSISAVGVLAPHSALAVLEDTVDYP
本发明的HAV-HBV-HEV联合疫苗还含有0.5-0.7w/v％用量的明胶。
实施例2
一种用于制备上述HAV-HBV-HEV联合疫苗的方法：
(a)在制备最终的HAV-HBV-HEV联合疫苗之前，将灭活HAV吸附于氢氧化铝凝胶，将重组HBsAg吸附于氢氧化铝凝胶，将重组HEV蛋白吸附于氢氧化铝凝胶，调整pH至5.5-9.6；
(b)将调整了pH的上述组份混合。
下面进一步举例说明。
实施例3：灭活HAV原液的制备
按照疫苗制备要求，采用人二倍体成纤维细胞MRC5进行HAV疫苗株HM175的细胞培养，将培养所得的病毒纯化后用福尔马林灭活，具体制备方法和技术路线如下：
(1)培养人二倍体成纤维细胞MRC5，待细胞长成单层后，用Hanks’液充分洗涤细胞单层，除去残留的小牛血清，接种HAV疫苗株HM175，37℃吸附2小时，弃去接种物，再洗涤，然后加入不含小牛血清的培养液，37℃培养，待细胞病变达“+++”时收获，冻融3次后离心，制备HAV种子批，用空斑试验滴定其感染滴度，分装后低温保存；
(2)如上所述，大量培养HAV疫苗株HM175，收获后加入终浓度为1％NP40，冻融3次后离心，收集冻融上清液；
(3)用超滤法浓缩病毒，再用葡聚糖柱层析或密度梯度离心法纯化病毒；
(4)纯化病毒经纯度鉴定后，用终浓度1∶4000的福尔马林灭活，37℃作用15天；
(5)用细胞培养多次传代的方法检测有无残留活病毒，同时对灭活病毒进行蛋白浓度和抗原滴度的测定。
实施例4：重组HBsAg的制备
培养通过基因工程方法制备的可以表达重组HBsAg的酵母细胞，通过离心获得的酵母细胞沉淀以1∶2的比例稀释到缓冲液中(0.5M NaCl，10mM EDTA，0.01％HgSO4，pH 7.0)。稀释后的溶液流经玻璃珠搅拌器破碎细胞壁。获得的溶液加入0.5％的中性表面活性剂，4℃搅拌混合均匀。得到的溶液中加入NaOH至pH11，然后4搅拌混合5小时。得到的溶液加入HCl至pH4。离心去除沉淀，调整pH值至7.0。然后用硅胶吸附、葡聚糖层析等方法纯化重组HBsAg，纯化后产物通过电泳验证并用以疫苗制备。
重组HBsAg也可按2000年版《中国生物制品规程》中《重组(CHO细胞)乙型肝炎疫苗制造及检定规程》制备。
实施例5：重组HEV蛋白的表达和纯化
(1)以HEV 4型中国株基因序列为模板，用引物1(5’-CCC CCC ATGGTT ATC CAG GAC TAT GAT AAT C-3’)和引物2(5’-CCC CTC GAG TCAAGG GTA ATC AAC AGT GTC CTC CA-3’)扩增ORF2编码多肽453-631(p179)的基因片段。PCR条件为：94℃-45秒，52℃-45秒，72℃-50秒，35个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶回收纯化，克隆入质粒载体pET28(a)+中。
(2)将表达质粒转化入表达菌株E.coli BL-21(DE3)中，挑取单菌落，用含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基培养至OD550＝0.6～0.8，用终浓度为0.2～1.0mM IPTG进行诱导，诱导温度为37℃，摇床摇速为200rpm，3-4小时后离心收集菌体，用细胞裂解液(50mM Tris-HCl，pH7.2，300mM NaCl)悬浮菌体沉淀，冻融6次后超声破碎菌体，离心收集上清液，再用离子交换、葡聚糖层析等方法进行纯化，最后使用UV280、SDS-PAGE等方法进行检测。
实施例6：制备灭活HAV、重组HBsAg、重组HEV蛋白氢氧化铝凝胶吸附溶液。
为了增加免疫原性，分别将灭活HAV、重组HBsAg和重组HEV蛋白吸附于氢氧化铝凝胶：(1)将灭活HAV的病毒原液和氢氧化铝凝胶搅拌混合；(2)将重组HBsAg和氢氧化铝凝胶搅拌混合；(3)将重组HEV蛋白和氢氧化铝凝胶搅拌混合。再将(1)和(2)以及(3)所得的溶液混合，调整甲型肝炎灭活疫苗的病毒抗原含量为500U/mL，重组HBsAg的浓度为20μg/mL，戊型肝炎病毒重组蛋白浓度为20μg/mL，氢氧化铝凝胶的浓度为1.0mg/mL；所得的混合溶液即为灭活HAV和重组HBsAg以及重组HEV蛋白氢氧化铝凝胶吸附溶液。
实施例7：HAV-HBV-HEV联合疫苗的免疫原性研究
A：实验动物分组和免疫方案
选用6-8周龄的雌性BALB/C纯系小鼠370只(扬州大学比较医学实验中心提供)，随机分为37组，每组10只。1组：空白对照组，注射氢氧化铝凝胶(浓度为1.0mg/mL)，0.1mL/只；2组：灭活甲肝疫苗组，注射灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为200U/mL)，0.1mL/只；3组：灭活甲肝疫苗组，注射灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为500U/mL)，0.1mL/只；4组：灭活甲肝疫苗组，注射灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为1000U/mL)，0.1mL/只；5组：重组乙肝疫苗组，注射重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为10μg/mL)，0.1mL/只；6组：重组乙肝疫苗组，注射重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为20μg/mL)，0.1mL/只；7组：重组乙肝疫苗组，注射重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为40μg/mL)，0.1mL/只；8组：重组戊肝疫苗组，注射重组HEV蛋白(10μg/mL)，0.1mL/只；9组：重组戊肝疫苗组，注射重组HEV蛋白(20μg/mL)，0.1mL/只；10组：重组戊肝疫苗组，注射重组HEV蛋白(50μg/mL)，0.1mL/只；11组：HAV-HBV-HEV联合疫苗组，注射灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为200U/mL)+重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为10μg/mL)+重组HEV蛋白(10μg/L)，0.1mL/只；12组：HAV-HBV-HEV联合疫苗组，注射灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为200U/mL)+重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为10μg/mL)+重组HEV蛋白(20μg/mL)，0.1mL/只；13组：HAV-HBV-HEV联合疫苗组，注射灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为200U/mL)+重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为10μg/mL)+重组HEV蛋白(50μg/mL)，0.1mL/只；14组：HAV-HBV-HEV联合疫苗组，注射灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为200U/mL)+重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为20μg/mL)+重组HEV蛋白(10μg/mL)，0.1mL/只；15组：HAV-HBV-HEV联合疫苗组，注射灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为200U/mL)+重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为20μg/mL)+重组HEV蛋白(20μg/mL)，0.1mL/只；16组：HAV-HBV-HEV联合疫苗组，注射灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为200U/mL)+重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为20μg/L)+重组HEV蛋白(50μg/mL)，0.1mL/只；17组：HAV-HBV-HEV联合疫苗组，注射灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为200U/mL)+重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为40μg/mL)+重组HEV蛋白(10μg/mL)，0.1mL/只；18组：HAV-HBV-HEV联合疫苗组，注射灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为200U/mL)+重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为40μg/mL)+重组HEV蛋白(20μg/mL)，0.1mL/只；19组：HAV-HBV-HEV联合疫苗组，注射灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为200U/mL)+重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为40μg/mL)+重组HEV蛋白(50μg/mL)，0.1mL/只；20组：HAV-HBV-HEV联合疫苗组，注射灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为500U/mL)+重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为10μg/L)+重组HEV蛋白(10μg/mL)，0.1mL/只；21组：HAV-HBV-HEV联合疫苗组，灭活注射甲肝疫苗(病毒抗原含量为500U/mL)+重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为10μg/mL)+重组HEV蛋白(20μg/mL)，0.1mL/只；22组：HAV-HBV-HEV联合疫苗组，注射灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为500U/mL)+重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为10μg/mL)+重组HEV蛋白(50μg/mL)，0.1mL/只；23组：HAV-HBV-HEV联合疫苗组，注射灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为500U/mL)+重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为20μg/mL)+重组HEV蛋白(10μg/mL)，0.1mL/只；24组：HAV-HBV-HEV联合疫苗组，注射灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为500U/mL)+重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为20μg/mL)+重组HEV蛋白(20μg/mL)，0.1mL/只；25组：HAV-HBV-HEV联合疫苗组，注射灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为500U/mL)+重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为20μg/mL)+重组HEV蛋白(50μg/mL)，0.1mL/只；26组：HAV-HBV-HEV联合疫苗组，注射灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为500U/mL)+重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为40μg/mL)+重组HEV蛋白(10μg/mL)，0.1mL/只；27组：HAV-HBV-HEV联合疫苗组，注射灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为500U/mL)+重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为40μg/mL)+重组HEV蛋白(20μg/mL)，0.1mL/只；28组：HAV-HBV-HEV联合疫苗组，注射灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为500U/mL)+重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为40μg/mL)+重组HEV蛋白(50μg/mL)，0.1mL/只；29组：HAV-HBV-HEV联合疫苗组，灭活注射甲肝疫苗(病毒抗原含量为1000U/mL)+重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为10μg/mL)+重组HEV蛋白(10μg/mL)，0.1mL/只；30组：HAV-HBV-HEV联合疫苗组，注射灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为1000U/mL)+重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为10μg/mL)+重组HEV蛋白(20μg/mL)，0.1mL/只；31组：HAV-HBV-HEV联合疫苗组，注射灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为1000U/mL)+重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为10μg/mL)+重组HEV蛋白(50μg/mL)，0.1mL/只；32组：HAV-HBV-HEV联合疫苗组，注射灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为1000U/mL)+重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为20μg/mL)+重组HEV蛋白(10μg/mL)，0.1mL/只；33组：HAV-HBV-HEV联合疫苗组，注射灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为1000U/mL)+重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为20μg/mL)+重组HEV蛋白(20μg/mL)，0.1mL/只；34组：HAV-HBV-HEV联合疫苗组，注射灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为1000U/mL)+重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为20μg/mL)+重组HEV蛋白(50μg/mL)，0.1mL/只；35组：HAV-HBV-HEV联合疫苗组，注射灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为1000U/mL)+重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为40μg/mL)+重组HEV蛋白(10μg/mL)，0.1mL/只；36组：HAV-HBV-HEV联合疫苗组，注射灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为1000U/mL)+重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为40μg/mL)+重组HEV蛋白(20μg/mL)，0.1mL/只；37组：HAV-HBV-HEV联合疫苗组，注射灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为1000U/mL)+重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为40μg/mL)+重组HEV蛋白(50μg/mL)，0.1mL/只；各组实验动物分别于0、4、6周注射相应疫苗三次，其中0周背部皮下多点注射0.1mL相应疫苗，4、6周腹腔注射0.05mL相应疫苗。
B：检测方法：
B-1：血清采集
所有动物均于免疫前、免疫后2、4、6、8、10、14、18、24、48周经眼眶静脉采血，-70℃冻存，于实验结束后统一检测。
B-2：甲肝、乙肝、戊肝抗体的检测
ELISA检测各组动物血清(1∶100稀释)，检测各动物抗体产生情况，以1∶10的免疫前血清作为阴性对照，P/N比值大于2.1为抗体阳性血清。
ELISA法检测甲肝、乙肝、戊肝抗体产生情况，并以1∶100为起点，系列稀释血清，检测抗体滴度。
C：结果
C-1：如表1-1所示，使用不同剂量的甲肝灭活疫苗免疫小鼠的结果表明，产生阳性血清小鼠的百分数随甲肝灭活疫苗免疫剂量的提高而升高。如表1-2所示，免疫血清中甲肝抗体滴度随甲肝疫苗免疫剂量、免疫次数的增加而升高，第3、4组在8-10周时达到最高水平(1∶102400)，48周后免疫血清滴度仍可维持1∶51200。
表1-1不同剂量的灭活甲肝疫苗诱生小鼠抗HAV阳性血清的结果
表1-2不同剂量的灭活甲肝疫苗诱生小鼠甲肝抗体的产生水平
C-2：如表2-1所示，使用不同剂量的重组乙肝疫苗免疫小鼠的结果表明，产生阳性血清小鼠的百分数随重组乙肝疫苗免疫剂量的提高而升高。如表2-2所示，免疫血清中乙肝抗体滴度随重组乙肝疫苗免疫剂量、免疫次数的增加而升高，第6组和7组在8-10周时达到最高水平(1∶102400)，第7组48周后免疫血清滴度仍可维持1∶51200。
表2-1不同剂量的重组乙肝疫苗诱生小鼠乙肝抗体的产生结果
表2-2不同剂量的重组乙肝疫苗诱生小鼠乙肝抗体的产生水平
C-3：如表3-1所示，使用不同剂量的重组HEV蛋白免疫小鼠的结果表明，产生阳性血清小鼠的百分数与重组戊肝疫苗免疫剂量无明显相关，全部小鼠均能产生阳性血清。如表3-2所示，各组动物免疫血清抗体滴度于8-10周时达到最高水平(1∶102400)，在48周后免疫血清滴度仍可维持1∶25600。
表3-1不同剂量的重组戊肝疫苗诱生小鼠戊肝抗体的产生情况
表3-2不同剂量的重组戊肝疫苗诱生小鼠戊肝抗体的产生水平
C-4：如表4-1、4-2、4-3所示，灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为200U/mL)与不同剂量的重组乙肝疫苗和重组戊肝疫苗进行联合免疫小鼠的结果表明，2、11、12、13、14、15、16、17、18、19组中均有60％的动物能诱导出抗HAV的阳性血清。说明HAV-HBV-HEV联合疫苗(灭活甲肝病毒抗原含量为200U/mL)与单价灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为200U/mL)在诱导动物产生甲肝抗体的免疫应答中无明显差异。
表4-1：灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为200U/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(灭活HAV含量为200U/mL)免疫诱生小鼠抗HAV阳性血清的结果
表4-2灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为200U/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(灭活HAV含量为200U/mL)免疫诱生小鼠抗HAV抗体滴度
表4-3灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为200U/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(灭活HAV含量为200U/mL)免疫诱生小鼠抗HAV抗体滴度
C-5：如表5-1所示，甲肝灭活疫苗(病毒抗原含量为500U/mL)与不同剂量的重组乙肝疫苗和戊肝疫苗进行联合免疫小鼠的结果表明，3、20、21、22、23、24、25、26、27、28组中均有100％的动物能诱导出抗HAV的阳性血清。
表5-1、5-2、5-3表明，HAV-HBV-HEV联合疫苗(灭活甲肝病毒抗原含量为500U/mL)与单价灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为500U/mL)在诱导动物产生甲肝抗体的免疫应答中无明显差异。
表5-1：灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为500U/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(灭活HAV含量为500U/mL)免疫诱生小鼠抗HAV阳性血清的结果
表5-2：灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为500U/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(灭活HAV含量为500U/mL)免疫诱生小鼠抗HAV抗体滴度
表5-3：灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为500U/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(灭活HAV含量为500U/mL)免疫诱生小鼠抗HAV抗体滴度
C-6：如表6-1所示，甲肝灭活疫苗(病毒抗原含量为1000U/mL)与不同剂量的重组乙肝疫苗和戊肝疫苗进行联合免疫小鼠的结果表明，4、29、30、31、32、33、34、35、36、37组中均有100％的动物能诱导出抗HAV的阳性血清。
表6-1、6-2、6-3表明，HAV-HBV-HEV联合疫苗(灭活甲肝病毒抗原含量为1000U/mL)与单价灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为1000U/mL)在诱导动物产生甲肝抗体的免疫应答中无明显差异。
表6-1：灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为1000U/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(灭活HAV含量为1000U/mL)免疫诱生小鼠抗HAV阳性血清的结果
表6-2灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为1000U/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(灭活HAV含量为1000U/mL)免疫诱生小鼠抗HAV抗体滴度
表6-3灭活甲肝疫苗(病毒抗原含量为1000U/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(灭活HAV含量为1000U/mL)免疫诱生小鼠抗HAV抗体滴度
C-7：如表7-1所示，重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为10μg/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(重组HBsAg含量为10μg/mL)免疫小鼠的结果表明，第5组有60％的动物能诱导出抗HBV的阳性血清，第11、12、13组有80％的动物能诱导出抗HBV的阳性血清，而20、21、22、29、30、31组中所有动物能诱导出抗HBV的阳性血清。
表7-2和表7-3表明，与单价重组乙肝疫苗相比，不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗免疫小鼠后，小鼠乙肝抗体产生水平明显高于单价重组乙肝疫苗组。
表7-1：重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为10μg/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(重组HBsAg含量为10μg/mL)免疫诱生小鼠抗HRV阳性血清的结果
表7-2：重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为10μg/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(重组HBsAg含量为10μg/mL)免疫诱生小鼠抗HBV抗体滴度
表7-3：重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为10μg/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(重组HBsAg含量为10μg/mL)免疫诱生小鼠抗HBV抗体滴度
C-8：如表8-1所示，重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为20μg/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(重组HBsAg含量为20μg/mL)免疫小鼠的结果表明，第6组有90％的动物能诱导出抗HBV的阳性血清，14、15、16、23、24、25、32、33、34组中均有100％的动物能诱导出抗HBV的阳性血清。
表8-2和表8-3表明，与单价重组乙肝疫苗相比，不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗免疫小鼠后，小鼠乙肝抗体产生水平明显高于单价重组乙肝疫苗组。
表8-1：重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为20μg/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(重组HBsAg含量为20μg/mL)免疫诱生小鼠抗HBV阳性血清的结果
表8-2：重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为20μg/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(重组HBsAg含量为20μg/mL)免疫诱生小鼠抗HBV抗体滴度
表8-3：重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为20μg/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(重组HBsAg含量为20μg/mL)免疫诱生小鼠抗HBV抗体滴度
C-9：如表9-1所示，重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为40μg/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(重组HBsAg含量为40μg/mL)免疫小鼠的结果表明，7、17、18、19、26、27、28、35、36、37组中均有100％的动物能诱导出抗HBV的阳性血清。
表9-2和表9-3表明，与单价重组乙肝疫苗相比，不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗免疫小鼠后，小鼠乙肝抗体产生水平明显高于单价重组乙肝疫苗组。
表9-1：重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为40μg/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(重组HBsAg含量为40μg/mL)免疫诱生小鼠抗HBV阳性血清的结果
表9-2：重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为40μg/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(重组HBsAg含量为40μg/mL)免疫诱生小鼠抗HBV抗体滴度
表9-3重组乙肝疫苗(重组HBsAg含量为40μg/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(重组HBsAg含量为40μg/mL)免疫诱生小鼠抗HBV抗体滴度
C-10：如表10-1所示，重组戊肝疫苗(重组HEV蛋白含量为10μg/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(重组HEV蛋白含量为10μg/mL)免疫小鼠的结果表明，8、11、14、17、20、23、26、29、32、35组中均有100％的动物能诱导出抗HEV的阳性血清。
表10-2和表10-3表明，与单价重组戊肝疫苗相比，不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗免疫小鼠后，小鼠戊肝抗体产生水平明显高于单价重组戊肝疫苗组。
表10-1：重组戊肝疫苗(重组HEV蛋白含量为10μg/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(重组HEV蛋白含量为10μg/mL)免疫诱生小鼠抗HEV阳性血清的结果
表10-2：重组戊肝疫苗(重组HEV蛋白含量为10μg/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(重组HEV蛋白含量为10μg/mL)免疫诱生小鼠HEV抗体滴度
表10-3：重组戊肝疫苗(重组HEV蛋白含量为10μg/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(重组HEV蛋白含量为10μg/mL)免疫诱生小鼠HEV抗体滴度
C-11：如表11-1所示，重组戊肝疫苗(重组HEV蛋白含量为20μg/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(重组HEV蛋白含量为20μg/mL)免疫小鼠的结果表明，9、12、15、18、21、24、27、30、33、36组中均有100％的动物能诱导出抗HEV的阳性血清。
表11-2和表11-3表明，与单价重组戊肝疫苗相比，不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗免疫小鼠后，小鼠戊肝抗体产生水平明显高于单价重组戊肝疫苗组。
表11-1：重组戊肝疫苗(重组HEV蛋白含量为20μg/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(重组HEV蛋白含量为20μg/mL)免疫诱生小鼠抗HEV阳性血清的结果
表11-2：重组戊肝疫苗(重组HEV蛋白含量为20μg/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(重组HEV蛋白含量为20μg/mL)免疫诱生小鼠HEV抗体滴度
表11-3：重组戊肝疫苗(重组HEV蛋白含量为20μg/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(重组HEV蛋白含量为20μg/mL)免疫诱生小鼠HEV抗体滴度
C-12：如表12-1所示，重组戊肝疫苗(重组HEV蛋白含量为50μg/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(重组HEV蛋白含量为50μg/mL)免疫小鼠的结果表明，10、13、16、19、22、25、28、31、34、37组中均有100％的动物能诱导出抗HEV的阳性血清。
表11-2和表11-3表明，与单价重组戊肝疫苗相比，不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗免疫小鼠后，小鼠戊肝抗体产生水平明显高于单价重组戊肝疫苗组。
表12-1：重组戊肝疫苗(重组HEV蛋白含量为50μg/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(重组HEV蛋白含量为50μg/mL)免疫诱生小鼠抗HEV阳性血清的结果
表12-2：重组戊肝疫苗(重组HEV蛋白含量为20μg/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(重组HEV蛋白含量为20μg/mL)免疫诱生小鼠HEV抗体滴度
表12-3：重组戊肝疫苗(重组HEV蛋白含量为20μg/mL)与不同剂量配比的HAV-HBV-HEV联合疫苗(重组HEV蛋白含量为20μg/mL)免疫诱生小鼠HEV抗体滴度
以上的实验结果表明，与单价灭活甲肝疫苗、单价重组乙肝疫苗和单价重组戊肝疫苗相比，HAV-HBV-HEV联合疫苗能够明显增加重组HBsAg和重组HEV蛋白的免疫原性(表7-2、7-3、8-2、8-3、9-2、9-3、10-2、10-3、11-2、11-3、12-2、12-3)；而联合疫苗诱导的甲肝抗体水平与单价灭活甲肝疫苗无明显区别(表4-2、4-3、5-2、5-3、6-2、6-3)。
实施例8：HAV-HBV-HEV联合疫苗的安全性研究
根据上述实验结果以及以往的研究，我们采用的HAV-HBV-HEV联合疫苗的优选配方中含有灭活甲肝抗原500U/mL、重组HBsAg 20μg/mL、重组戊肝抗原20μg/mL。并以此配方制备HAV-HBV-HEV联合疫苗进行安全性研究。
研究选用6-8周龄的雌性BALB/C纯系小鼠为研究对象，采用联合疫苗的5倍、10倍常规剂量免疫动物，同时设空白组作为实验对照，连续观察动物的生理特征变化，包括毛发、食欲、睡眠以及死亡情况。研究结果表明，与空白组实验动物相比，所有实验动物均未出现任何的不良反应情况。因此，本实施例证实HAV-HBV-HEV联合疫苗具有良好的安全性。
实施例9：HAV-HBV-HEV联合疫苗的稳定性研究
根据上述实验结果以及以往的研究，我们采用的HAV-HBV-HEV联合疫苗的优选配方中含有灭活甲肝抗原500U/mL、重组HBsAg 20μg/mL、重组戊肝抗原20μg/mL。并以此配方制备HAV-HBV-HEV联合疫苗，贮存于4℃，检测12个月内HAV-HBV-HEV联合疫苗的稳定性。
研究选用6-8周龄的雌性BALB/C纯系小鼠为研究对象，分别取贮存0、6和12个月的联合疫苗进行免疫，免疫采用0、4、6周免疫方案，其中0周背部皮下多点注射0.1mL联合疫苗，4、6周腹腔注射0.05mL联合疫苗。第10周经眶静脉采血，观察动物甲肝、乙肝、戊肝抗体的产生情况。结果如下表所示。
HAV-HBV-HEV联合疫苗的稳定性研究
因此，本实施例证实HAV-HBV-HEV联合疫苗在4℃贮存12个后，仍然能够诱导动物产生高水平的甲肝、乙肝和戊肝抗体。说明HAV-HBV-HEV联合疫苗具有良好的稳定性。
序列表
<110>东南大学
<120>甲型肝炎-乙型肝炎-戊型肝炎联合疫苗
<160>2
<210>1
<211>271
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(271)
<400>1
ArgGlyIleAlaLeuThrLeuPheAsnLeuAlaAspThrLeuLeuGlyGlyLeuProThr
GluLeuIleSerSerAlaGlyGlyGlnLeuPheTyrSerArgProValValSerAlaAsn
GlyGluProThrValLysLeuTyrThrSerValGluAsnAlaGlnGlnAspLysGlyIle
AlaIleProHisAspIleAspLeuGlyGluSerArgValValIleGlnAspTyrAspAsn
GlnHisGluGlnAspArgProThrProSerProAlaProSerArgProPheSerValLeu
ArgAlaAsnAspValLeuTrpLeuSerLeuThrAlaAlaGluTyrAspGlnThrThrTyr
GlySerSerThrAsnProMETTyrValSerAspThrValThrPheValAsnValAlaThr
GlyAlaGlnGlyValSerArgSerLeuAspTrpSerLysValThrLeuAspGlyArgPro
LeuMETThrIleGlnGlnTyrSerLysThrPhePheValLeuProLeuArgGlyLysLeu
SerPheTrpGluAlaGlyThrThrLysAlaGlyTyrProTyrAsnTyrAsnThrThrAla
SerAspGlnIleLeuIleGluAsnAlaAlaGlyHisArgValCysIleSerThrTyrThr
ThrAsnLeuGlySerGlyProValSerIleSerAlaValGlyValLeuAlaProHisSer
AlaLeuAlaAlaLeuGluAspThrValAspTyrProAlaArgAlaHisThrPheAspAsp
PheCysProGluCysArgAlaLeuGlyLeu
<210>2
<211>179
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
ValIleGlnAspTyrAspAsnGlnHisGluGlnAspArgProThrProSerProAlaPro
SerArgProPheSerValLeuArgAlaAsnAspValLeuTrpLeuSerLeuThrAlaAla
GluTyrAspGlnThrThrTyrGlySerSerThrAsnProMETTyrValSerAspThrVal
ThrPheValAsnValAlaThrGlyAlaGlnGlyValSerArgSerLeuAspTrpSerLys
ValThrLeuAspGlyArgProLeuThrThrIleGlnGlnTyrSerLysThrPheTyrVal
LeuProLeuArgGlyLysLeuSerPheTrpGluAlaGlyThrThrLysAlaGlyTyrPro
TyrAsnTyrAsnThrThrAlaSerAspGlnIleLeuIleGluAsnAlaAlaGlyHisArg
ValCysIleSerThrTyrThrThrAsnLeuGlySerGlyProValSerIleSerAlaVal
GlyValLeuAlaProHisSerAlaLeuAlaValLeuGluAspThrValAspTyrPro
机译： 甲型肝炎和乙型肝炎联合疫苗
机译： 用于治愈甲型，丙型，丁型，戊型和乙型肝炎的病毒性肝炎的止痛药。
机译： 甲型和乙型肝炎联合疫苗
