心肌缺血预适应大鼠循环血中微囊泡通过抑制内质网应激发挥抗大鼠心肌缺血/再灌注损伤

摘要

目的：
　　建立大鼠心肌缺血预适应(IPC)模型，提取循环血中的微囊泡(IPC-MVs)。对IPC-MVs进行表型鉴定及数量分析，并探讨IPC-MVs对大鼠在体心肌缺血/再灌注(I/R)损伤的作用及与内质网应激(ERS)介导的细胞凋亡途径相关的作用机制。方法：
　　1.大鼠在体心肌I/R损伤及IPC模型的建立
　　健康雄性Wistar大鼠随机分为3组：假手术(Sham), I/R及IPC组。Sham组：冠状动脉左前降支(LAD)下穿线后不予结扎；I/R组：LAD下穿线行心肌缺血30 min及再灌注120 min处理，对心肌造成I/R损伤；IPC组：LAD下穿线行心肌缺血5 min及再灌注5 min，循环3次的短暂I/R预处理，再行缺血30 min及再灌注120 min的I/R处理。监测Ⅱ导联心电图(ECG)、动脉收缩压(SBP)及舒张压(DBP)，监测缺血期各类室性心律失常(VA)发生情况，台盼蓝/TTC染色检测心肌梗死面积。
　　2. IPC-MVs的提取、表型鉴定及计数
　　健康雄性Wistar大鼠随机分为2组：Sham及IPC组。Sham组：LAD下穿线后不阻断血流，旷置30min；IPC组：LAD下穿线后行缺血5 min及再灌注5 min，循环3次后自腹主动脉取血，血液经枸橼酸钠抗凝并经两步离心得到无血小板血浆(PFP)。取90μL PFP运用流式细胞术对MVs进行表型鉴定及计数。剩余PFP经超速离心得到IPC-MVs，用于后期处理大鼠。在PFP中分别加入血小板、内皮细胞、白细胞及红细胞的表面标志物CD61, CD144, CD45及Erythroid Cells单抗，并加入1,2μm的标准微球流式上机检测。
　　3.IPC-MVs对I/R大鼠MAP, HR,ST-段水平及心肌组织坏死的影响
　　健康雄性Wistar大鼠随机分为3组：Sham, I/R及IPC-MVs+I/R组。Sham组：LAD下穿线后不阻断血流，旷置150 min，于旷置25 min自股静脉注射相应体积的生理盐水(NS)；I/R组：给予I/R处理，于缺血25 min注射相应体积的NS；IPC-MVs+I/R组：给予I/R处理，于缺血25 min注射依蛋白定量计算后的IPC-MVs7 mg/kg。监测ECG,SBP及DBP，记录缺血期VA发生情况，微板法检测血清乳酸脱氢酶(LDH)活力，台盼蓝/TTC染色测定心肌梗死面积，苏木素-伊红(HE)染色观察心肌组织形态改变。
　　4. IPC-MVs对I/R大鼠心肌细胞凋亡的影响
　　实验分组同方法3。原位末端标记法(TUNEL)检测心肌细胞凋亡指数(AI)，微量酶标法检测心肌组织Caspase3活力。
　　5. IPC-MVs对I/R大鼠心肌组织中内质网相关蛋白表达的影响
　　实验分组同方法3。微量酶标法检测心肌组织Caspase12活力，Western blot法检测心肌组织葡萄糖调控蛋白78(GRP78)及转录因子C/EBP同源蛋白(CHOP)的表达水平。
　　结果：
　　1.成功建立大鼠在体心肌I/R损伤及IPC模型
　　大鼠心肌I/R损伤模型建立成功。与缺血前相比，缺血立即平均动脉压(MAP)显著下降且ST-段显著抬高(56.62±9.10 mmHgvs85.86±10.71 mmHg;0.322±0.034 mVvs0.012±0.031 mV,P<0.001)，至缺血30 min末，ST-段抬高至峰值(0.500±0.060mV)。心率(HR)于I/R期间进行性下降，至再灌注120 min末，HR较缺血前相比明显降低(285±22次/min vs464±20次/min, P<0.001)。缺血期室早(VPC)首次出现时间早(6.54±1.11 min)，室早个数为205±33；室速(VT)首次出现时间早(8.36±1.28min)，持续时间长(0.68±0.41min)，二者发生率均为100％；室颤(VF)发生率为75%。心肌组织梗死区/危险区(IS/AAR)为43.04±6.26%。
　　与I/R组相比，IPC组缺血期末ST-段抬高幅度显著降低(0.403±0.043 mV vs0.500±0.060 mV, P<0.01)，再灌注末HR显著恢复(327±11次/min vs285±22次/min,P<0.01)。缺血期VPC(16.49±9.49minvs6.54±1.11 min,P<0.01)及VT(15.23±2.40 min vs8.36±1.28 min, P<0.001)首次出现时间明显推迟，VPC个数明显减少(15±23 vs205±33, P<0.001)，VT持续时间明显缩短(0.12±0.18 min vs0.68±0.41min,P<0.05)，VT及VF的发生率降低(37.5%vs100%;0%vs75%, P<0.01)；心肌梗死面积明显缩小(18.76±4.18%vs43.04±6.26%, P<0.001)。大鼠心肌IPC模型建立成功。
　　2. IPC-MVs的提取、表型鉴定及计数
　　大鼠循环血经2,600 g，15 min和10,000 g，5 min两步离心得到PFP。采用33,000 rpm,148 min，4℃离心得到IPC-MVs。流式检测的1μm以下且对应荧光抗体呈阳性的微粒即定义为不同细胞来源的 IPC-MVs。与 Sham组相比， IPC-MVs中血小板来源MVs(PMVs,1094±181 events/μL vs719±115 events/μL, P<0.05)、内皮细胞来源 MVs(EMVs,475±42 events/μL vs388±34 events/μL,P<0.05)和红细胞来源MVs(RMVs,1539±212 events/μL vs1200±171 events/μL, P<0.05)的数量均显著增加，但 MVs总数(4380±745 events/μL vs3453±307 events/μL)和白细胞来源MVs(LMVs,117±20events/μLvs91±11 events/μL)的数量无显著性变化。
　　3.IPC-MVs改善I/R大鼠HR, ST-段水平并减轻心肌组织坏死程度
　　I/R及IPC-MVs+I/R组全程MAP变化趋势一致，组间无显著性差别。全程HR变化趋势一致，至再灌注120 min末，IPC-MVs+I/R组HR较I/R组明显恢复(331±9次/min vs305±13次/min, P<0.01)；两组缺血期ST-段均进行性抬高，再灌注后逐渐回落。至再灌注120 min末，与I/R组相比，IPC-MVs+I/R组ST-段水平显著降低(0.043±0.027 mVvs0.097±0.056 mV,P<0.05)；组间缺血期VA发生情况无显著性差异。与Sham组相比，I/R及IPC-MVs+I/R组血清LDH活力于缺血30 min及再灌注120 min均显著升高(P<0.001)，与I/R组相比， IPC-MVs+I/R组LDH活力于再灌注120 min明显下降(10.975±1.005 U/mLvs12.910±1.111 U/mL,P<0.01)。IPC-MVs+I/R组心肌梗死面积较I/R组显著缩小(29.63±3.90%vs40.50±2.54%,P<0.001)，提示心肌组织损伤程度明显减轻。
　　4. IPC-MVs抑制I/R诱发的大鼠心肌细胞凋亡
　　与I/R组相比，IPC-MVs+I/R组心肌细胞AI显著降低(22.98±1.61%vs34.14±1.26%,P<0.001)。心肌组织Caspase3活力较I/R组显著下降(54.35±3.75 U/μgvs71.23±4.35 U/μg,P<0.001)。
　　5. IPC-MVs通过抑制ERS抗I/R大鼠心肌损伤
　　IPC-MVs+I/R组心肌组织Caspase12活力较I/R组显著下降43%(P<0.05)。Western blot检测结果显示，与I/R组相比，IPC-MVs+I/R组GRP78及CHOP的蛋白表达量均显著下降(0.47±0.07% vs0.77±0.10%, P<0.001;0.68±0.07% vs0.89±0.10%, P<0.01)。
　　结论：
　　1.成功建立大鼠在体心肌I/R损伤及IPC模型。
　　2.流式检测证实粒径小于1μm的微粒即为IPC-MVs，且来源于血小板、内皮细胞、白细胞和红细胞。其中PMVs, EMVs及RMVs的数量显著增加。
　　3.静脉注射7 mg/kg的IPC-MVs可显著恢复I/R大鼠再灌注末HR，降低再灌注末ST-段水平和血清LDH活力，缩小心肌梗死面积，减轻组织坏死程度。
　　4.静脉注射7 mg/kg的IPC-MVs可明显减轻I/R所致的大鼠心肌细胞凋亡，表现为降低心肌细胞AI和Caspase3活力。
　　5.IPC-MVs显著降低I/R大鼠心肌组织内Caspase12活力，下调GRP78及CHOP蛋白的表达，其产生的心肌保护效应是通过抑制ERS介导的细胞凋亡途径实现的。

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缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、大鼠在体心肌I/R损伤及IPC模型的建立

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3 结果

1.4 小结

二、IPC-MVs的提取、表型鉴定及计数

2.1实验材料

2.2 实验方法

2.3结果

2.4 小结

三、IPC-MVs对I/R大鼠

3.1实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果

3.4 小结

四、IPC-MVs对I/R大鼠心肌细胞凋亡的影响

4.1实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果

4.4 小结

五、IPC-MVs通过抑制ERS抗I/R大鼠心肌损伤

5.1实验材料

5.2 实验方法

5.3 结果

5.4 小结

讨论

1. IPC模型诱导大鼠在体产生IPC-MVs

2. 大鼠循环血中IPC-MVs的提取与保存

3. IPC-MVs的检测方法

4. IPC-MVs对I/R大鼠心肌组织损伤的作用

5. IPC-MVs对I/R大鼠心肌细胞凋亡的影响

6. IPC-MVs与ERS的关系

7. 总结与展望

全文结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:细胞微囊泡的生物学特性研究进展

致谢

个人简历