柚皮苷对废用性骨质疏松的预防作用及其机制

摘要

目的：
　　1.探究柚皮苷对大鼠废用性骨质疏松的预防作用。
　　2.探究柚皮苷是否通过促进骨膜素(Periostin)和Semphorin3A(Sema3A)表达，进而激活Wnt/β-catenin信号通路，从而预防废用性骨质疏松的发生。
　　3.体外实验条件下，探究柚皮苷是否通过促进骨膜素表达，进而激活Wnt/β-catenin信号通路，从而促进成骨细胞分化。
　　方法：
　　1.选取6个月龄雄性SD大鼠90只，随机分为5组，每组18只：正常对照组(Control)，单纯骨质疏松造模组和低、中、高剂量柚皮苷预防组，后4组通过鼠尾悬吊4周建立废用性骨质疏松模型，后3组分别于造模前4周和造模后4周灌服30mg·kg-1·d-1，100mg·kg-1·d-1和300mg·kg-1·d-1柚皮苷，前2组灌服等量生理盐水。造模4周后处死取材，取各组大鼠血清进行骨代谢指标I型胶原C端肽(CTX-1)和I型前胶原氨基端肽(P1NP)检测，取各组大鼠股骨，检测股骨干和股骨颈生物力学性能，测量股骨远端骨密度(BMD)，对各组大鼠股骨远端进行Micro-CT扫描、苏木素-伊红染色液(HE)染色、骨钙素(osteocalcin，OCN)免疫组化染色和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色。
　　2.取各组胫骨，通过 RT-PCR和 qRT-PCR检测胫骨中 Sema3A、Neuropilin-1(NRP1)、骨膜素、骨硬化蛋白(Sclerostin)和β-catenin的 mRNA水平，通过Western-blot检测Sema3A、骨膜素、骨硬化蛋白和细胞核β-catenin蛋白的表达情况，并对各组股骨行Sema3A、骨膜素和骨硬化蛋白免疫组化染色。
　　3.体外培养小鼠成骨前体样细胞MC3T3-E1，分为空白对照组，以及0.2ng/ml、2ng/ml、20ng/ml、100ng/ml柚皮苷处理组，检测各组碱性磷酸酶(ALP)的活性以筛选出促进成骨细胞分化的最佳柚皮苷浓度。相对于空白对照组，在最佳浓度柚皮苷刺激下，通过PCR检测成骨细胞分化特异性基因BMP-2、OCN和Runx2的表达情况，通过PCR和Western-blot检测Sema3A、骨膜素以及β-catenin的mRNA及蛋白的表达情况。观察骨膜素特异性抗体能否抑制柚皮苷促进成骨细胞ALP活性的上调。
　　结果：
　　1.造模4周后，相对于正常对照组，单纯造模组股骨力学性能和股骨远端BMD显著下降，股骨远端骨小梁微结构遭到显著破坏，单纯造模组血清P1NP显著下降，CTX-1显著上升，股骨远端成骨细胞OCN免疫组化强度显著下降，股骨远端TRAP染色显示破骨细胞数量显著增加。100mg·kg-1·d-1和300mg·kg-1·d-1柚皮苷能够显著预防悬吊引起的股骨力学性能下降和骨密度降低，并改善悬吊破坏的骨小梁微结构，中、高剂量柚皮苷能够显著上调血清P1NP水平，下调CTX-1，并显著增强股骨远端OCN的免疫组化强度，减少小梁周围破骨细胞数量。
　　2.造模4周后，相对于正常对照组，胫骨Sema3A、骨膜素和核β-catenin的表达水平显著下降，骨硬化蛋白表达显著增加，股骨免疫组化染色显示骨外膜成骨细胞分泌的骨膜素显著减少，股骨远端成骨细胞分泌的Sema3A显著下调，股骨干骨细胞骨硬化蛋白免疫染色阳性强度显著上升。相对于单纯造模组，中、高剂量柚皮苷显著增加胫骨Sema3A、骨膜素与核β-catenin的表达水平，减少骨硬化蛋白表达，股骨免疫组化染色显示骨外膜成骨细胞分泌的骨膜素显著增加，股骨远端成骨细胞分泌的Sema3A显著上调，股骨干骨硬化蛋白免疫染色阳性强度显著下降。
　　3.相对于空白对照组，20ng/ml柚皮苷促进成骨细胞分化的能力最强，20ng/ml柚皮苷显著促进 BMP-2、OCN、Runx2、Sema3A、骨膜素、Nrp1和β-catenin的mRNA的表达，Western-blot结果显示20ng/ml柚皮苷显著增加Sema3A、骨膜素和核β-catenin蛋白的表达。骨膜素特异性抗体能够抑制20ng/ml柚皮苷对成骨细胞分化的促进作用。
　　结论：
　　1.柚皮苷具有促进骨形成并抑制骨重吸收的双重作用，能够预防大鼠废用性骨质疏松的发生。
　　2.柚皮苷可能是通过上调骨膜素，进而下调骨硬化蛋白，从而激活Wnt/β-catenin信号通路，以及上调Semaphorin3A进而激活Wnt/β-catenin信号通路这两条信号路径促进骨质合成。
　　3.柚皮苷可能通过上调成骨前体样细胞中骨膜素的表达，以自分泌或旁分泌的方式激活Wnt/β-catenin信号通路从而促进成骨细胞分化。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、柚皮苷对废用性骨质疏松的预防作用

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4 小结

第二部分 柚皮苷预防废用性骨质疏松发生的分子机制

2.1对象和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4 小结

第三部分 柚皮苷通过激活Wnt信号通路促进成骨细胞分化

3.1对象和方法

3.2 实验结果

3.3 讨论

3.4 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: 柚皮苷防治骨质疏松的研究现状

致谢

个人简历