血红素氧合酶-1-血管内皮祖细胞途径在血红素结合蛋白改善大鼠局灶性脑缺血再灌注后认知障碍中的作用

摘要

目的：
　　缺血再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）损伤是缺血性脑卒中的重要发病基础，可以破坏血管内皮和引起血管内皮功能障碍。血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）可分化成熟为血管内皮，参与受损血管的修复和血管再生。血红素结合蛋白（hemopexin, HPX）可以特异性的结合并清除多余的游离血红素，发挥神经保护作用，而血红素氧合酶-1（heme oxygenase-1, HO-1）是该过程的限速酶。利用大鼠局灶性缺血再灌注损伤模型，我们的前期研究发现，HPX可以减轻大鼠缺血再灌注后的脑梗死面积，但是其具体机制并不甚清楚。本实验研究拟探讨HO-1- EPCs途径在HPX改善大鼠局灶性缺血再灌注后认知功能障碍中的作用。
　　方法：
　　将雄性SD（Sprague–Dawley,SD）大鼠，7-8周龄，体重250-280g，随机（随机数字表法）分为5组（n=20）:假手术（Sham）组、局灶性缺血再灌注（middle cerebral artery occlusion,MCAO）组、溶剂对照（MCAO+Vehicle）组、HPX治疗（MCAO+HPX）组以及HO-1抑制剂锌原卟啉Ⅸ（MCAO+HPX+ZnppIX）组。采用大脑中动脉栓塞方法，制作大鼠局灶性缺血再灌注模型，生理盐水、溶剂（Vehicle）叠氮钠、HPX以及HO-1特异性抑制剂（zinc protoporphyrin IX， ZnppIX）均于缺血再灌注后即刻经侧脑室注射(intracerebroventricular injection, i.v.)方式给予。HPX给予剂量为10μl(1.86μg/μl), MCAO组大鼠侧脑室注射10μl生理盐水（0.9％NaCl）, MCAO+Vehicle组大鼠侧脑室注射10μl叠氮钠（0.1%NaN3），MCAO+HPX+ZnppIX组大鼠侧脑室给予10μl HPX和HO-1特异性抑制剂(zinc protoporphyrin IX， ZnppIX)的混合液（HPX1.86μg/μl+0.1%NaN3）。
　　第一部分：侧脑室注射HPX对大鼠局灶性缺血再灌注后行为学的影响。实验分为 Sham组、MCAO组、MCAO+Vehicle组、MCAO+HPX组和 MCAO+HPX+ZnppIX组,造模方法如上，造模前以及缺血再灌注后12h、24h、3d、5d、7d分别采用改良的神经功能缺损评分(modified neurological severity scores， mNSS)评价各组大鼠神经功能损伤程度；采用Morris水迷宫（morris water maze,MWM）视频采集系统检测各组大鼠缺血再灌注后2-7 d的逃避潜伏期以及缺血再灌注后第7d时在目标象限的时间百分比及穿过站台次数。
　　第二部分：HO-1-EPCs途径在HPX改善大鼠局灶性I/R后认知障碍中的作用。首先，将实验分为Sham组、MCAO组、MCAO+Vehicle组、MCAO+HPX组，造模方法同第一部分。I/R后2h、6h、12h、24 h和7d取各组大鼠缺血半暗带区脑组织，采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction, RT-PCR）法检测缺血半暗带区脑组织中HO-1 mRNA的水平变化；利用蛋白质免疫印迹试验(western blot)检测大鼠缺血半暗带区脑组织中HO-1蛋白质的表达；然后将大鼠随机分为 Sham组、MCAO组、MCAO+Vehicle组、MCAO+HPX组以及MCAO+HPX+ZnppIX组，造模方法同第一部分，使用毛细采血管取各组大鼠内眦球后静脉丛血,通过流式细胞技术(flowcytometer, FC)鉴定和定量分析技术结合CD34/CD133双抗体标记技术,检测I/R后2h、6h、12h、24h、7d各组大鼠外周血中EPCs数量变化。
　　第三部分:侧脑室注射HPX对大鼠局灶性I/R后缺血半暗带区血管再生的影响。将大鼠随机分为Sham组、MCAO组、MCAO+Vehicle组、MCAO+HPX组以及MCAO+HPX+ZnppIX组，造模方法同第一部分，I/R后7d取各组大鼠冠状面脑组织，即刻切脑组织冰冻切片。采用免疫组织化学技术结合免疫荧光显色技术检测大鼠缺血半暗带皮质区、海马区以及纹状体区的新生血管数量，了解EPCs向血管内皮细胞的分化程度以及血管再生情况。
　　结果：
　　第一部分：与 Sham组相比，局灶性缺血再灌注损伤可以明显造成大鼠神经功能缺损（p＜0.05），延长其逃避潜伏期（p＜0.05），减少其目标象限时间百分比和穿过站台次数（p＜0.05）；侧脑室注射HPX治疗可以明显减轻大鼠局灶性I/R后的神经功能缺损（p＜0.05），缩短大鼠局灶性 I/R后在水迷宫中的逃避潜伏期（p＜0.05），增加大鼠在水迷宫中的目标象限时间百分比和穿过站台次数（均p＜0.05），提高其学习记忆能力；侧脑室注射叠氮钠对大鼠局灶性 I/R后的神经功能缺损和学习记忆能力并无显著影响（p＞0.05）；和HPX组大鼠相比，侧脑室注射HPX的同时给予HO-1抑制剂ZnppIX, HPX改善大鼠神经功能缺损以及提高大鼠在水迷宫中的表现的作用消失（p＜0.05）。
　　第二部分：与 Sham组相比，局灶性缺血再灌注损伤可以诱导缺血半暗带区的HO-1 mRNA的转录水平升高和其蛋白质的表达增加（均p＜0.05），且在I/R后24h达到高峰，并使外周血中的EPCs数量增加（p＜0.05）；侧脑室注射HPX治疗可以显著增加大鼠局灶性I/R后不同时间点缺血半暗带区脑组织中的HO-1的蛋白质表达以及其mRNA的转录水平（均p＜0.05），上调外周血中的EPCs数量（p＜0.05）；叠氮钠侧脑室注射对大鼠局灶性 I/R后不同时间点缺血半暗带区脑组织中的HO-1的蛋白质表达及其mRNA的水平和外周血中的EPCs数量无明显影响（p＞0.05）。利用HO-1特异性抑制剂ZnppIX抑制HO-1的活性，可以逆转 HPX对 EPCs的骨髓动员到外周血的作用，使外周血中的 EPCs数量降低（p＜0.05）。
　　第三部分：与Sham组相比，局灶性缺血再灌注损伤可以诱导d大鼠缺血再灌注后损伤后7d时缺血半暗带区的血管再生（p＜0.05）；侧脑室注射HPX可以明显增加大鼠缺血半暗带皮质区、海马区以及纹状体区 I/R后的新生血管数量（p＜0.05）；叠氮钠对大鼠缺血半暗带区域的新生血管数量无显著影响（p＞0.05）；ZnppIX可以抑制逆转 HPX促进大鼠 I/R后缺血半暗带区血管再生的作用（p＜0.05）。
　　结论：
　　HPX可明显减轻大鼠局灶性脑I/R损伤后认知障碍，其机制可能是HPX通过上调HO-1，动员骨髓中的EPCs增殖迁移到外周血中，进而归巢到缺血半暗带区脑组织中，促进其分化成熟并诱导新生血管形成，从而参与受损血管修复和血管再生。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、侧脑室注射HPX对大鼠局灶性脑缺血再灌注后行为学的影响

1.1对象和材料

1.2实验方法

1.3结果

1.4讨论

1.5小结

二、HO-1-EPCs途径在HPX改善大鼠局灶性I/R后认知障碍中的作用

2.1对象和材料

2.2 实验方法

2.3 结果

2.4讨论

2.5小结

三、侧脑室注射HPX对大鼠局灶性脑缺血再灌注后缺血半暗带区血管再成的影响

3.1对象和材料

3.2 实验方法

3.3 结果

3.4讨论

3.5小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: 内皮祖细胞治疗作用研究进展

致谢

个人简历