血红素结合蛋白对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用研究

摘要

背景：
　　脑卒中因其发病率、致残率、死亡率高,已成为威胁国人健康和生命安全的头号杀手。目前针对脑中风治疗策略的研究已有很大进展,但仍存在治疗时间窗窄,临床疗效有限以及副作用大等尚未克服的难题。针对这些问题寻找新的治疗方法已成为亟需解决的重大科学问题。
　　血红素结合蛋白(hemopexin,HPX)是一种与游离的血红素具有极高亲和力的血浆蛋白,其主要生理功能在于清除有害的游离血红素(Heme)。除此之外,HPX还广泛参与机体的多种生理和病理过程并在其中发挥保护作用,包括游离Heme介导的肺的氧化应激损伤,肝脏缺血再灌注(I/R)的损伤以及I型糖尿病。饶有兴味的是,HPX在中枢神经系统也有表达,但其表达的具体部位和细胞类型尚无确定结论,其在中枢神经系统内的具体功能也少有研究。近年来,有学者用体外培养神经元细胞及基因敲除手段证明HPX有神经保护作用,但尚缺乏其脑内分布、缺血后的变化的确切证据。本研究旨在检测HPX在大鼠正常脑组织中具体的表达定位,并利用大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)的动物模型,探讨HPX经中枢途径在体给药对于局灶性脑缺血再灌注损伤的神经保护作用,从而为脑缺血再灌注损伤的治疗提供新的思路,奠定理论基础。
　　实验一：血红素结合蛋白在大鼠脑组织中的表达定位及其缺血后的表达变化
　　目的:观察血红素结合蛋白在正常大鼠脑组织的表达定位以及局灶性脑缺血损伤后缺缺血半暗带区该蛋白的表达变化
　　方法：
　　①HPX在正常大鼠脑组织中的表达
　　雄性SD大鼠6只,3只深麻醉后处死,取脑并匀浆后进行Westernblotting检测HPX的表达水平;其余3只深麻醉后灌注,应用免疫荧光双标染色,观察HPX与NeuN(神经元特异性标志物)以及GFAP(星形胶质细胞特异性标志物)的共定位情况。
　　②短暂局灶性脑缺血后HPX在缺血半暗带区表达量的变化
　　雄性SD大鼠18只,随机分为假手术(sham)组(n=2)和大脑中动脉阻塞(MCAO)组(n=16)。其中MCAO组大鼠再次随机化分为四组(n=4),建立MCAO动物模型,分别于再灌注后的2h,6h,12h和24h处死动物并取梗死同侧半暗带脑组织用Westernblotting检测相应时间点HPX表达量的变化。
　　③短暂局灶性脑缺血后HPX表达定位的变化
　　雄性SD大鼠6只,随机分为sham组(n=3)和MCAO组(n=3)。MCAO组动物于I/R24h深麻醉后灌注取脑,切片进行免疫荧光双标染色,观察脑内HPX的表达变化以及HPX与NeuN以及GFAP共定位的情况。
　　结果：
　　(1)Westernblotting:结果显示,HPX在正常大鼠的脑组织中可见表达;I/R2h,6h,12hHPX在缺血半暗带区的表达无明显改变,I/R24h其表达上调。(2)免疫荧光双标染色:在正常大鼠脑组织中,HPX主要表达于脉管系统(脉络丛和室管膜的上皮细胞)和海马神经元,以及脉管系统内皮下层的少部分星形胶质细胞的胞浆中。(3)I/R24hHPX表达开始上调,HPX表达增加主要定位于缺血半暗带区以及邻近脑组织的神经元和星形胶质细胞内。
　　结论:HPX在大鼠脑内主要表达于脉管系统和海马区神经元,以及位于脉管内皮下层的少量星形胶质细胞上,I/R24hHPX在缺血半暗带及其邻近脑组织的神经元和星形胶质细胞的表达增高。
　　实验二：血红素结合蛋白侧脑室注射对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用
　　目的：探讨不同剂量的血红素结合蛋白通过中枢途径在体给药对于局灶性脑缺血的神经保护作用
　　方法：50只雄性SD大鼠随机分5组(n=10):MCAO(con)组;溶剂(vehicle)组;即侧脑室注射0.1％叠氮化钠5μl;以及不同剂量的给药组【分别侧脑室注射5μl不同浓度的HPX(溶解于0.1%叠氮化钠):0.46mg/ml(低剂量组),0.93mg/ml(中剂量组)和1.86mg/ml(高剂量组)】。各给药组和vehicle组大鼠建立大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,缺血时间120min,再灌注即刻经侧脑室注射给药,24h进行神经行为学评分(NBS),然后处死大鼠,取脑进行TTC染色分别测算各组大鼠脑梗死容积百分比。
　　结果：(1)NBS评分:与con组和vehicle组相比,再灌注24h高剂量给药组(1.86mg/ml)和中剂量给药组(0.93mg/ml)大鼠的NBS评分明显提高(P<0.011.86mg/ml组vscon组;P<0.011.86mg/ml组vsvehicle组;P<0.050.93mg/ml组vscon组;P<0.050.93mg/ml组vsvehicle组)。其他各组间NBS评分两两比较均无显著差异。(2)脑梗死容积百分比:与con组和vehicle组相比,再灌注24h高剂量给药组(1.86mg/ml)和中剂量给药组(0.93mg/ml)大鼠的脑梗死容积明显缩小(P<0.011.86mg/ml组vscon组;P<0.011.86mg/ml组vsvehicle组;P<0.050.93mg/ml组vscon组;P<0.050.93mg/ml组vsvehicle组),且高剂量组的脑梗死容积明显小于中剂量组(P<0.05)。其他各组间梗死容积百分比两两比较均无显著差异。
　　结论：血红素结合蛋白对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤有神经保护作用,且呈剂量依赖性。
　　实验三：血红素结合蛋白对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的远期保护效应
　　目的：探索血红素结合蛋白通过中枢途径给药对于局灶性脑缺血再灌注损伤的远期保护作用
　　方法：雄性SD大鼠16只随机分为给药组和vehicle组,建立MCAO动物模型,于再灌注即刻分别侧脑室注射5μl1.86mg/ml的HPX(给药组)或等剂量0.1%叠氮化钠(vehicle组)。再灌注即刻起,每24h记录各组动物的行为学功能评分,直至MCAO后7d,然后处死大鼠,取脑进行TTC染色测算I/R7d时各组大鼠的脑梗死容积。结果:与vehicle组相比,I/R1d-7d给药组(1.86mg/ml)大鼠的神经行为学评分均明显提高(P<0.01),且再灌注后7d给药组(1.86mg/ml)大鼠的脑梗死容积明显缩小(P<0.01)。
　　结论：HPX对局灶性脑缺血再灌注损伤的神经保护作用可持续至再灌后7d。
　　小结：
　　1.HPX在大鼠脑内主要表达在室管膜上皮细胞、海马区神经元和围绕毛细血管的星形胶质细胞的胞浆中,且在脑缺血再灌注24h表达上调。
　　2.HPX侧脑室给药对于局灶性脑缺血再灌注损伤有神经保护作用,且呈剂量依赖性。
　　3.HPX对大鼠的局灶性脑缺血再灌注损伤具有远期保护效应。

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实验一 血红素结合蛋白在大鼠脑组织中的表达定位及其缺血后的表达变化

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 血红素结合蛋白侧脑室注射对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 血红素结合蛋白对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的远期保护效应

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

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