Lin28A激活AR并促进ER-/Her2+乳腺癌生长进展的研究

摘要

目的：
　　研究ER-/Her2+乳腺癌中Lin28A和AR的表达并分析它们的表达与患者预后的关系；分析Lin28A是否能够影响AR的表达情况以及Lin28A是否以及如何影响AR的转录活性，并研究Lin28A对AR的转录影响是否对ER-/Her2+乳腺癌的生长和进展起作用。
　　方法：
　　采用免疫组化分析305例ER阴性Her2阳性（ER-/Her2+）乳腺癌组织中Lin28A和AR的表达。305例ER-/Her2+乳腺癌Lin28A和AR的表达与临床病理特征的关系。采用 SPSS软件包种的卡方检验进行组间差异统计学分析。根据文献报道，选择ER-/Her2+的MDA-MB-453和SK-BR-3乳腺癌细胞系作为本实验研究模型。采用免疫荧光法检测 ER-/Her2+乳腺癌细胞MDA-MB-453和SK-BR-3中Lin28A和AR的表达，并用Q-RT-PCR和Western-blot检测ER-/Her2+乳腺癌细胞中Lin28A和AR的mRNA以及蛋白表达水平。ER-/Her2+乳腺癌患者中Lin28A/AR的表达与预后关系采用Kaplan-Meier生存曲线以及Cox回归模型进行统计分析。Lin28A干扰质粒（Lin28A siRNA）和Lin28A过表达质粒（Lin28A）由吉凯基因（中国上海）化学合成。C-myc干扰质粒（c-myc shRNA）和过表达质粒（c-myc）由天津医科大学公共实验室提供。采用脂质体转染法将Lin28A siRNA和Lin28A质粒分别转入MDA-MB-453和SK-BR-3乳腺癌细胞中，然后用Q-RT-PCR和Western-blot分别验证Lin28A对AR和c-myc的mRNA以及蛋白表达水平的影响。采用ChIP和双荧光素酶报告基因实验分析Lin28A对AR转录活性的影响。MTT细胞增值实验检测Lin28A对ER-/Her2+乳腺癌细胞增殖的影响，Boyden小室细胞迁移实验检测Lin28A对ER-/Her2+乳腺癌细胞迁移作用的影响，平板克隆形成实验检测Lin28A对ER-/Her2+乳腺癌细胞克隆形成能力的影响，流式细胞术检测Lin28A对ER-/Her2+乳腺癌细胞周期和细胞凋亡的作用，最后在雌性裸鼠体内进行验证。
　　结果：
　　1、乳腺癌组织免疫组化结果显示305例 ER-/Her2+乳腺癌样本中，有240例(78.7%) Lin28A阳性表达；有220例(72.1%) AR阳性表达。在AR表达阳性的样本中，有75%的病例Lin28A阳性表达，即Lin28A和AR在ER-/Her2+乳腺癌中共同表达或同时不表达；Lin28A和AR共同阳性表达(Lin28+/AR+)与ER-/Her2+乳腺癌患者高组织学分级（P=0.023）和高Ki67指数（P=0.020）密切相关；Kaplan-Meier曲线结果显示Lin28A+/AR+表达患者与Lin28A+/AR-表达患者相比总生存率较低（P=0.042），Lin28A+/AR+表达患者与Lin28A-/AR+(P=0.043）和Lin28A-/AR-（P=0.019）表达患者相比无复发生存率较低。Lin28A+/AR+表达(P=0.025)是ER?/Her-2+乳腺癌患者无复发生存的独立预后因子。
　　2、细胞免疫荧光结果显示Lin28A和AR在ER-/Her2+乳腺癌中共表达或同时不表达；Q-RT-PCR和Western-blot实验结果显示Lin28A和AR mRNA和蛋白在MDA-MB-453乳腺癌细胞中的表达高于MDA-MB-231乳腺癌细胞，在SK-BR-3乳腺癌细胞中的表达低于MDA-MB-231乳腺癌细胞。
　　3、在MDA-MB-453乳腺癌细胞中，干扰Lin28A后，Q-RT-PCR结果显示AR mRNA和c-myc mRNA分别降低了3.5倍和3倍；Western-blot结果显示干扰Lin28A后，AR蛋白和c-myc蛋白的表达水平都降低。在SK-BR-3乳腺癌细胞中，过表达Lin28A后，Q-RT-PCR结果显示AR mRNA和c-myc mRNA分别升高了2.3倍和2倍；Western-blot结果显示AR蛋白和c-myc蛋白的表达水平都有所升高。
　　4、双荧光素酶报告基因结果显示在MDA-MB-453乳腺癌细胞中，干扰Lin28A的表达后，AR启动子的活性降低；干扰c-myc的表达后，AR启动子的活性也降低。在SK-BR-3乳腺癌细胞中将Lin28A过表达后，AR启动子的活性增加；将c-myc过表达后，AR启动子的活性也增加。而继续干扰c-myc后能够反转 Lin28A促使 AR启动子的活性增加这一效应。ChIP实验结果显示在MDA-MB-453乳腺癌细胞中，Lin28A降表达能够降低c-myc对AR启动子的招募能力；在SK-BR-3乳腺癌细胞中Lin28A过表达能够增加c-myc对AR启动子的招募能力。
　　5、MTT细胞增殖实验结果显示在MDA-MB-453乳腺癌细胞中，将Lin28A干扰后，Lin28A降表达组与对照组相比，细胞的增殖能力降低；在SK-BR-3乳腺癌细胞中，将Lin28A过表达后，Lin28A过表达组与对照组相比，细胞的增殖能力增加。Boyden小室细胞迁移实验结果显示在MDA-MB-453乳腺癌细胞中Lin28A降表达组穿过基质膜的细胞数为31±4，对照组为91±5；在SK-BR-3乳腺癌细胞中，Lin28A过表达组穿过基质膜的细胞数为55±4，对照组为18±4。克隆形成实验结果显示在MDA-MB-453乳腺癌细胞中Lin28A降表达组形成的克隆数为45±5，对照组为110±10；在SK-BR-3乳腺癌细胞中Lin28A过表达组形成的细胞克隆数为77±5，对照组为24±4。流式细胞术测细胞周期结果显示在MDA-MB-453乳腺癌细胞中，Lin28A干扰组与对照组相比，G1期细胞比例增加，S期细胞比例降低；在SK-BR-3乳腺癌细胞中，Lin28A过表达组与对照组相比，G1期细胞比例降低，S期细胞比例增加。流式细胞术测细胞凋亡结果显示，在MDA-MB-453乳腺癌细胞中，Lin28A干扰组与对照组相比，凋亡细胞数增加；在SK-BR-3乳腺癌细胞中，Lin28A过表达组与对照组相比，凋亡细胞数减少。
　　6、裸鼠体内实验结果显示注射稳定转染后的Lin28A siRNA MDA-MB-453乳腺癌细胞组和对照组相比，小鼠肿瘤的生长能力降低；注射稳定转染后的Lin28A SK-BR-3乳腺癌细胞组和对照组相比，小鼠肿瘤的生长能力升高。Q-RT-PCR结果显示在小鼠体内肿瘤中，干扰Lin28A后，ARmRNA和c-myc mRNA的表达水平分别降低了3倍和8倍；过表达Lin28A后，ARmRNA和c-myc mRNA的表达水平分别升高了3.2倍和2.5倍。免疫组化结果显示在MDA-MB-453乳腺癌细胞中，Lin28A siRNA组与对照组相比，Lin28A、AR和Ki67的表达水平都降低；在SK-BR-3乳腺癌细胞中，Lin28A过表达组与对照组相比，Lin28A、AR和Ki67的表达水平都升高。所有小鼠的肺和肝都未出现转移。
　　结论：
　　Lin28A和AR在ER-/Her2+乳腺癌中共表达，并且这种共表达状态与患者不良预后密切相关；Lin28A通过调控c-myc影响AR的表达；Lin28A能够促进ER-/Her2+乳腺癌的生长和迁移，促进细胞周期G1期向S期转化，抑制凋亡；Lin28A是否可做为ER-/Her2+乳腺癌新的治疗靶点还有待进一步研究。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、Lin28A和AR在ER-/Her2+乳腺癌中的表达

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、Lin28A调控AR的表达并促进ER-/Her2+乳腺癌的生长

2.1对象和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: Lin28的功能研究新进展

致谢

个人简历