胶质瘤中EGFR/EGFRvⅢ下调抑癌基因AJAP1表达的机制研究

摘要

目的:
　　利用TCGA、Rambrant、CGGA三大数据库的信息学分析发现EGFR和AJAP1负性相关，尤其在四亚型分型（Classical, Mesenchymal, Neural, and Proneural）中存在EGFR扩增和突变的Classical亚型。结合EGFRvIII(EGFR突变持续激活)慢病毒系统和小分子阻断剂，我们验证并证实恶性胶质瘤通过 EGFR通路抑制抑癌基因AJAP1表达，从而增强其边缘侵袭能力，并且在体内和体外试验中验证MK2206可以有效阻断EGFRvIII下游通路活性，为EGFR扩增和EGFRvIII阳性恶性胶质瘤化疗提供新的方案。
　　方法：
　　1.生物信息学分析EGFR和AJAP1在不同临床样本数据库（TCGA、CGGA和 Ranmbrant）中基因拷贝数、mRNA、蛋白水平的高低；利用含 EGFRvIII表达载体的慢病毒转染U87和LN229,模拟胶质瘤细胞系中EGFR通路持续激活状态，在体外试验中验证EGFR通路激活对抑癌基因AJAP1转录表达的调控。
　　2.用表达 EGFRvIII突变体的慢病毒感染胶质瘤细胞系 U87和 LN229， Real-time PCR验证AJAP1 mRNA表达水平；蛋白免疫印迹方法检测EGFR、EGFRvIII、p-EGFR、AKT、p-AKT、AJAP1的表达水平变化；免疫荧光染色检测EGFR通路持续激活对胶质瘤细胞骨架和细胞形态的改变；Transwell实验检测EGFR通路持续激活对胶质瘤细胞迁移能力的影响。
　　3.针对性选择课题预测的功能信号通路 EGFR/EGFRvIII-PI3K-AKT-EZH2上不同节点的小分子抑制剂：LY294002（PI3K抑制剂）、MK2206（P-AKT抑制剂）、DZNEP（组蛋白三甲基化抑制剂），节段阻滞通路活性并观察AJAP1 mRNA和蛋白表达变化，观察通路阻滞后细胞骨架和形态改变是否恢复。
　　4.通过生物信息学分析预测H3K27Me3在AJAP1启动子区域结合位点，针对性设计Chip-PCR找出对照组、EGFR通路持续激活组和通路激活后治疗组（挑选P-AKT小分子抑制剂）三组处理后H3K27Me3在AJAP1启动子区结合量的变化。
　　5.构建胶质瘤EGFR/EGFRvIII颅内动物模型，研究P-AKT小分子抑制剂MK2206在颅内对EGFR/EGFRvIII下游AKT磷酸化的影响，体内实验验证阻断EGFR/ EGFRvIII-PI3K-AKT-EZH2后AJAP1表达量变化和肿瘤边缘侵袭情况。
　　结果：
　　1.信息学分析显示EGFR和AJAP1在基因拷贝数上没有明显相关，但是在mRNA水平存在明显负相关；在 TCGA、CGGA和 Ranmbrandt三个数据库中EGFR富集的classcial亚型中，AJAP1和EGFR存在明显负相关，提示EGFR和AJAP1存在转录前调控关系。
　　2.转染EGFRvIII病毒的胶质瘤细胞中EGFRvIII、p-EGFR和p-AKT表达明显上调,并且 AJAP1表达水平明显下降；共聚焦显微镜成像显示过表达EGFRvIII后胶质瘤细胞AJAP1表达降低，且F-actin染色显示丝状伪足增多和板状伪足减少；Transwell实验显示EGFRvIII过表达后细胞迁移能力明显增强。
　　3.胶质瘤细胞系过表达AJAP1后出现丝状伪足减少和板状伪足增多。
　　4.在过表达 EGFRvIII的胶质瘤细胞系中，梯度浓度使用 PI3K抑制剂（LY294002）、p-AKT抑制剂（MK2206）和组蛋白三甲基化抑制剂（DZNEP）后 AJAP1蛋白表达量上升；共聚焦显微镜成像显示过表达 EGFRvIII组经过p-AKT抑制剂处理后AJAP1表达上调，且出现丝状伪足减少和板状伪足增多。
　　5.免疫荧光染色显示EGFRvIII过表达后细胞核中H3K27Me3上调，P-AKT抑制剂MK2206处理后H3K27Me3表达下调；在核蛋白免疫印迹试验中出现同样的结果。
　　6. Chi-PCR实验显示过表达EGFRvIII后H3K27Me3在AJAP1启动子区结合量增加，p-AKT抑制剂MK2206处理后结合量下降。
　　7.87-Vector/87-EGFRvIII混合胶质瘤颅内模型证实P-AKT抑制剂能成功阻断EGFR/EGFRvIII下游AKT的磷酸化并上调AJAP1表达量，HE染色显示治疗组正常组织和肿瘤边界相对于对照组更加清晰。
　　结论：
　　1. EGFR/ EGFRvIII信号通路激活可以改变胶质瘤细胞骨架结构，增加胶质瘤迁移能力。
　　2. p-AKT、EZH2在过表达EGFRvIII胶质瘤细胞系中参与下调AJAP1。
　　3.体内外研究显示阻断EGFR/ EGFRvIII- AKT- EZH2可以上调AJAP1表达。
　　4. EGFR/EGFRvIII通过p-AKT/EZH2信号传导通路上调AJAP1启动子区H3K27Me3结合量，从而下调AJAP1表达。
　　5. p-AKT小分子抑制剂MK2206对EGFR/EGFRvIII信号通路异常激活的胶质瘤存在治疗效果。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

1对象和方法

1.1. 实验对象

1.2. 实验方法

2结果

2.1. 临床数据库分析显示EGFR和AJAP1的表达存在负相关性

2.2. EGFR/EGFRvIII可以通过下调AJAP1表达进而重构细胞骨架

2.3. EGFR/EGFRvIII下游信号通路PI3K-AKT-EZH2的激活可以下调AJAP1表达进而重构细胞骨架

2.4. EGFR/EGFRvIII下游信号通路激活能导致组蛋白修饰重构

2.5. EGFR / EGFRvIII 下游信号通路激活能上调在 AJAP1 基因启动子区域的H3K27me3结合量

2.6. MK2206能在裸鼠颅内过表达EGFRvIII恶性胶质瘤模型中抑制边缘侵袭

3讨论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:针对表观基因组学研究对癌症治疗前景的论述

致谢

个人简历