基于3D模型Rac1和RhoA在胶质瘤侵袭与迁移中的作用研究

摘要

目的：胶质瘤是中枢神经系统(central nervous system, CNS)发病率最高的肿瘤，胶质母细胞瘤(glioblastoma multiform, GBM)恶性度最高，预后最差，GBM呈侵袭性生长，手术难以全切，残余肿瘤复发率较高，是导致肿瘤难治性的主要原因之一。因而，抑制肿瘤细胞的侵袭迁移，成为治疗胶质瘤的重要策略。Rho蛋白属于Ras超家族成员之一，在恶性肿瘤细胞的侵袭和迁移方面发挥重要作用，Rac1和RhoA是Rho亚家族重要成员，分别介导间质运动和变形虫样运动，是恶性胶质瘤细胞两种重要的侵袭迁移方式的主要调控因子。近期有研究通过划痕实验抑制Rac1的活性可以降低细胞的迁移能力，然而在3D基质中未见相关研究。本研究基于3D水凝胶模型，建立细胞三维培养环境，探讨 Rac1和RhoA在胶质瘤细胞侵袭迁移中的作用机制，分别抑制Rac1活性和RhoA信号通路，观察间质运动和变形虫样运动是否被抑制，细胞的侵袭迁移能力如何变换，以及两种运动形式是否发生转换；同时抑制Rac1活性和RhoA信号通路，观察细胞的运动形式和侵袭迁移能力的改变，从而为胶质瘤的抗侵袭迁移治疗提供理论依据。
　　方法：利用French数据库分析Rac1和RhoA蛋白的表达情况与胶质细胞瘤病人总生存率之间的关系，利用TCGA数据库分析Rac1和RhoA蛋白分别在低级别胶质瘤(low grade glioma, LGG)和高级别胶质瘤(high grade glioma, HGG)中的表达情况，分析二者之间的关系；利用免疫组化检测Rac1和RhoA在非肿瘤性对照脑组织和人脑各级别胶质瘤手术标本中的表达水平；通过划痕实验检测经NSC23766和Y27632抑制后细胞的迁移能力；在3D水凝胶中培养细胞，分别应用NSC23766和Y27632处理细胞，通过激光共聚焦活细胞工作站观察肿瘤细胞的三维形态及运动形式转换；应用细胞免疫荧光技术观察不同处理条件下整合素表达特征。利用3D趋化实验，在活细胞工作站下观察细胞的运动趋化效应，利用软件计算细胞运动的速度、路程，描述细胞运动轨迹，观察不同处理条件下细胞的侵袭迁移能力变化。
　　结果：通过French和TCGA数据库分析，Rac1和RhoA表达水平与胶质瘤病人总生存期呈负相关(p=1.6e–0.6)，与肿瘤级别呈正相关(p<0.05)；免疫组化
　　显示Rac1和RhoA蛋白在非肿瘤性对照脑组织中低表达，在各级别胶质瘤中均有表达，表达水平与胶质瘤级别成正相关；在划痕实验中，与对照组相比较，当应用NSC23766和Y27632及联合应用两种抑制剂时，细胞的迁移能力明显受到抑制；在以3D水凝胶为基质的细胞三维培养条件下，可以观察到呈变形虫样运动的类圆形细胞，也可观察到呈间质运动的梭形的细胞；通过共聚焦活细胞工作站，可以观察到部分细胞由梭形转变为带有突出囊泡的类圆形形态，细胞发生间质－变形虫运动形式转换(mesenchymal-amoeboid transition, MAT)，部分细胞由类圆形转变为梭形，细胞发生变形虫－间质运动形式转换(amoeboid-mesenchymal transition, AMT)，发生MAT的细胞整合素表达降低，而发生AMT的细胞整合素表达增加；在活细胞工作站趋化实验中，NSC23766处理组与对照组相比较，细胞的运动速度、路程均增加（P<0.05），细胞的运动能力反而增强，说明细胞在单一抑制剂作用下，细胞由一种运动形式转换为另外一种速度更快的运动形式；在相同条件下，与对照组相比，Y27632组细胞运动速度、路程降低，细胞运动能力相对减弱（P<0.05），在NSC23766和Y27632联合作用下，细胞的运动速度、路程明显降低（P<0.05），细胞的运动能力明显减弱，没有观察到细胞形态改变。
　　结论：
　　1. Rac1和RhoA表达水平与胶质瘤总生存率呈负相关，与胶质瘤病理级别正相关。
　　2.当降低Rac1活性后，划痕实验证实胶质瘤U87细胞的迁移能力减弱，而3D趋化实验证实细胞的侵袭迁移能力增强，因细胞在3D水凝胶中发生MAT。
　　3.单一抑制Rac1或RhoA不能有效降低胶质瘤细胞的侵袭迁移能力，联合抑制Rac1活性和RhoA信号通路可有效降低细胞的侵袭迁移能力，从而为胶质瘤的抗侵袭迁移治疗提供理论依据。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、Rac1、RhoA蛋白在胶质瘤中的表达及与病人预后相关性研究

1.1材料和方法

1.2 结果

1.3 讨论

1.4 小结

二、以Rac1和RhoA信号通路为导向的间质－变形虫样运动转换和变形虫－间质运动转换

2.1 材料和方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4小结

三、3D水凝胶中胶质瘤细胞侵袭迁移能力的研究

3.1材料和方法

3.2结果

3.3 讨论

3.4 小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:Rho与胶质瘤细胞侵袭迁移研究进展

致谢