组蛋白甲基化修饰相关蛋白在ISO诱导的心肌肥厚中的作用

摘要

背景:
　　心血管疾病是医学界始终难以攻克的一大难关。心肌肥厚是多种心血管疾病发生发展的必然结果，也是心血管疾病中最危险的因素之一。初期的心肌肥厚是一种适应性的反应，但是长期的心肌肥厚将最终造成心脏功能衰竭，终末期死亡率极高。由于各种信号通路相互交织，汇聚，造成心脏的肥大性生长，引起转录系统的紊乱。
　　伴随基因组学的发展，表观遗传修饰在疾病机制中的作用日益受到重视，尤其是组蛋白甲基化修饰调控基因的表达，被认为与多种病理性信号通路相关，参与多种疾病的发生发展，已经成为近些年研究的热点。组蛋白甲基化修饰研究涉及较多的是组蛋白去甲基化酶LSD1以及组蛋白甲基化酶EZH2。LSD1可以对组蛋白H3第4位赖氨酸（H3K4）以及组蛋白H3第4位赖氨酸（H3K9）的甲基化状态进行去甲基化，发挥生物学功能，在许多疾病类型中，LSD1表达的增加与其功能的获得呈正相关，由于LSD1对于H3K4，H3K9的调节在正常细胞以及癌细胞中都是起关键性作用的基因，故通过改变LSD1表达引起组蛋白甲基化状态的改变，可能在某些疾病的发生和发展过程中起重要作用。EZH2通过对组蛋白H3第27位赖氨酸（H3K27）的三甲基化发挥其功能，研究表明心肌祖细胞分化为心肌细胞过程中EZH2及H3K27三甲基化水平增加，EZH2的稳定性及功能增强可抑制心肌肥厚，有报道称MicroRNA-214通过抑制EZH2引起心肌肥厚，但是关于EZH2与心肌肥厚的关系仍不明确。因此，深入探讨组蛋白甲基化修饰的状态变化与心肌肥厚信号通路之间的关系十分必要。
　　目的:
　　1．探讨赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1（Lysine specific demethylase1, LSD1）在异丙基肾上腺素（Isoproterenol，ISO）诱导的病理性心肌肥厚发病机制中的作用，研究组蛋白甲基化修饰与心肌肥厚的相关性，为开发治疗和预防病理性心肌肥厚的有效临床药物寻找新靶点。
　　2.构建特异性的大鼠EZH2（Enhancer ofzeste homolog2，组蛋白甲基转移酶的一种）过表达质粒以及EZH2催化亚基set domain缺失质粒，并在293T细胞中评估其表达水平，为本项目后期深入研究组蛋白甲基化修饰对心肌肥厚发生发展的潜在作用提供新工具。
　　方法:
　　一、LSD1抑制实验：选取健康雄性的Wistar大鼠，体重为140~180 g，SPF级饲养方式饲养48 h。首先，将实验大鼠24只，随机分成4组：正常对照组（CTRL），ISO处理组（ISO），LSD1抑制剂OGL002组（OGL002）和ISO处理+LSD1抑制剂OGL002组（ISO+OGL002），每组6只。ISO处理组及ISO+抑制剂OGL002组动物每天腹腔注射2 mg/kg ISO，CTRL及OGL002组腹腔注射相同体积的生理盐水，连续一周。一周后OGL002组及ISO+OGL002组动物每日腹腔注射LSD1抑制剂OGL002溶液，浓度为50μg/kg，溶解方法由公司提供，其余组注射等体积药品稀释液，处理连续一周。
　　二、LSD1过表达实验：另外选取实验大鼠24只，随机分为四组：正常对照组（CTRL），ISO处理组（ISO），正常大鼠LSD1过表达病毒浓缩组（LSD1 overexpression virus，LSD1-OV），和 ISO处理大鼠+LSD1过表达病毒浓缩组（ISO+LSD1 overexpression virus，ISO+LSD1-OV），每组6只。ISO及ISO+LSD1过表达病毒浓缩组大鼠每天腹腔注射2 mg/kg ISO，CTRL及正常大鼠LSD1过表达病毒浓缩组大鼠腹腔注射相同体积的生理盐水，连续一周，一周后正常大鼠LSD1过表达病毒浓缩组及ISO处理+LSD1过表达病毒浓缩组动物每日心室注射LSD1过表达浓缩病毒，CTRL和ISO处理组大鼠每日心室内注射等体积培养液，处理连续一周。
　　上述各组实验动物取心肌组织，通过心重比结果以及HE染色方法，检测各组大鼠心肌肥厚的表型发生情况；采用实时荧光定量PCR检测上述各组大鼠心肌组织中三种肥厚因子（MLC-2V, MHC, ANP）以及LSD1的mRNA表达情况；采用Western Blot、免疫组化、免疫荧光法检测LSD1及其作用下游的四种组蛋白H3K4me1，H3K4me2，H3K9me1，H3K9me2的蛋白表达水平。
　　三、构建EZH2基因过表达质粒：通过普通PCR与重叠PCR法，质粒与载体双酶切以及 T载体连接等基因方法构建大鼠 EZH2过表达质粒以及 SET domain缺失质粒，并通过脂质体转染法转入293T细胞中实现其表达，采用实时荧光定量PCR以及Western Blot对EZH2以及H3K27me3在RNA水平以及蛋白质表达水平进行验证。
　　结果:
　　一、LSD1抑制实验
　　（1）生理学指标显示 ISO组、LSD1抑制剂（OGL002）组以及 ISO+OGL002组与对照组相比，心率和血压均明显下调（n=6，P<0.01）。
　　（2）心肌表型及心重比显示ISO组、OGL002组以及ISO+OGL002组明显高于对照组，其中ISO+OGL002组最高，约为对照组的2倍（n=6，P<0.05）。
　　（3）HE染色结果显示结果表明ISO组、OGL002组及ISO+OGL002组与对照组相比细胞横截面积明显增大。
　　（4）心肌肥厚标志物qPCR检测结果显示，ISO组、OGL002组及ISO+OGL002组与对照组相比，三种肥厚因子（MLC-2V, MHC, ANP）表达水平均明显上调：其中 ISO+OGL002组肥厚因子表达水平最高，约为对照组的4-5倍。（n=6， P<0.05）。
　　（5）LSD1表达水平qPCR、Western Blot、免疫组化和免疫荧光检测显示，ISO组、OGL002组及ISO+OGL002组 LSD1的mRNA和蛋白表达水平均明显下调；对照组LSD1的mRNA约为ISO组和OGL002组4倍左右，约为ISO+OGL002组高6倍左右。（n=6，P<0.01）。
　　（6）LSD1下游四种组蛋白（H3K4me1，H3K4me2，H3K9me1，H3K9me2） Western Blot、免疫组化和免疫荧光检测显示，ISO组、OGL002组及ISO+OGL002组蛋白表达水平均明显上调，ISO+OGL002组LSD1蛋白表达水平最高。
　　二、LSD1过表达实验：
　　（1）生理学指标显示ISO组与对照组相比HR、Bp均明显下调，LSD1-OV组及ISO+LSD1-OV组与ISO组相比HR、Bp均明显上调（n=6，P<0.01）
　　（2）心肌表型及心重比显示 ISO组明显高于对照组; LSD1-OV组及ISO+LSD1-OV组明显低于ISO组（n=6，P<0.05）
　　（3）HE染色结果显示结果表明 ISO组与对照组相比细胞横截面积明显增大；LSD1-OV组及ISO+LSD1-OV组与ISO组相比，细胞横截面积显著减小。
　　（4）心肌肥厚标志物qPCR检测结果显示，ISO组与对照组相比，三种肥厚因子表达（MLC-2V、MHC、ANP）均明显上调；ISO+LSD1-OV组与ISO组相比，三种肥厚因子表达水平下调；LSD1-OV组与对照组相比，ANP表达水平下调（n=6， P<0.05）。
　　（5）LSD1表达水平qPCR、Western Blot、免疫组化和免疫荧光检测显示，ISO组的LSD1mRNA和蛋白表达水平均明显下调；ISO+LSD1-OV组与ISO组相比， LSD1-OV组与对照组相比，LSD1表达水平显著上调（n=6，P<0.01）。
　　（6）LSD1下游组蛋白（H3K4me1，H3K4me2，H3K9me1，H3K9me2） Western Blot、免疫组化和免疫荧光检测显示，ISO组四种组蛋白表达水平均明显上调， ISO+LSD1-OV组与 ISO组相比，LSD1-OV组与对照组相比均下调（n=6， P<0.01）。
　　三、构建EZH2基因过表达质粒：EZH2过表达质粒以及SET domain缺失质粒Western和实时荧光定量PCR检测结果显示在293T细胞中成功实现了EZH2两种质粒的过表达。由于SET domain位置的缺失，在验证构建的缺失SET domain区域的过表达质粒组中H3K27me3蛋白表达水平无改变，说明SET domain位置对于EZH2实现甲基化功能的重要性。
　　结论:
　　1．本研究初步证明了组蛋白甲基化修饰水平变化与心肌肥厚的相关性。ISO可能通过抑制LSD1的表达增加组蛋白甲基化水平，诱导肥厚因子上调，导致病理性心肌肥厚的发生。过表达LSD1可以部分逆转ISO诱导的病理性心肌肥厚，为LSD1作为心肌肥厚临床治疗的新靶点提供理论依据。
　　2．成功构建了特异性大鼠EZH2基因过表达质粒以及SET domain缺失质粒，为今后研究组蛋白甲基化修饰以及心肌肥厚信号通路之间的关系提供了工具。

目录

声明

缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

实验材料和方法

1.1实验材料

1.2实验方法

结果

2.1腹腔注射LSD1特异性抑制剂OGL002对心肌肥厚的影响

2.2心室注射LSD1基因特异性过表达浓缩病毒对心肌肥厚的影响

2.3质粒构建

讨论

1. 心肌肥厚相关信号通路

2. 病理性心肌肥厚动物模型

3. 心肌肥厚与组蛋白甲基化修饰的研究

4. 组蛋白去甲基化酶LSD1与心肌肥厚关系研究

5. EZH2过表达以及EZH2催化亚基set doamin缺失过表达质粒构建和鉴定

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:组蛋白修饰与心肌肥厚发病机制相关性的研究

致谢

个人简历