组蛋白甲基化修饰相关蛋白在压力负荷型心肌肥厚中的作用

摘要

背景： 伴随着科技的进步、人们的生活节奏加快和饮食结构的变化，心血管疾病发病率逐年增加，并且趋于年轻化[1]。心肌肥厚作为常见的心血管疾病，是一种可遗传疾病，可由多种因素引起，特别是可由长期动脉血压升高引发，即压力负荷型心肌肥厚，其与心力衰竭相关，继而可能引发猝死。心肌肥厚是多种疾病的临床征兆。 近年来，表观遗传学机制异常在各种疾病发生发展过程中的作用受到普遍重视。甲基化是组蛋白非常重要的表观遗传修饰形式之一，同时也是调节基因组功能的重要手段。赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1（Lysine specific demethylase1,LSD1）是第一个被发现的组蛋白特异性去甲基化酶。LSD1可以特异性催化组蛋白H3第4位赖氨酸H3K4和第9位赖氨酸H3K9一甲基化和二甲基化的去甲基修饰。多种肿瘤的发生与LSD1有关，也就是说LSD1的表观遗传学改变在多种肿瘤发生发展中扮演重要角色。然而对于LSD1在心肌肥厚中涉及的机制尚未阐明。本研究采用升主动脉缩窄手术制作压力负荷型心肌肥厚大鼠模型，探讨组蛋白去甲基化酶LSD1与压力负荷型心肌肥厚的关系，为发现心肌肥厚机制及进一步治疗奠定了基础。 目的： 1.探讨压力负荷型心肌肥厚的发生发展过程中LSD1的作用，了解组蛋白甲基化的状态对压力负荷型心肌肥厚的影响，从而为LSD1作为心肌肥厚临床治疗的新靶点提供理论依据。 2.构建大鼠LSD1过表达质粒以及LSD1去甲基化活性中心缺失质粒，并在HEK293T细胞中实现LSD1基因的过表达，为进一步研究LSD1与相关疾病的关系以及LSD1去甲基化作用奠定了基础。 方法： 一、选取健康雄性SD大鼠，称量体重为120～130g，SPF级饲养方法饲养大鼠，将实验大鼠随机分成3组：正常对照组（Control），假手术组（Sham）和升主动脉缩窄手术组（Transverse Aortic Constriction），每组6只。通过心重比、超声心动、Western Blot、RT-qPCR、组织学HE染色、免疫组化检测等多种实验方法，检测各组大鼠心脏功能、心肌肥厚表型、肥厚因子、LSD1及其下游组蛋白的表达。 二、通过PCR扩增特异性LSD1片段，重叠PCR扩增LSD1特异性的去甲基化作用缺失片段，并构建大鼠特异性LSD1过表达质粒和LSD1去甲基化活性中心缺失质粒，并经琼脂糖凝胶电泳和核酸测序进行验证。将验证后两种质粒与空白载体分别进行包病毒，感染HEK293T后用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞，再用Western blot和RT-qPCR等方法检测HEK293T细胞内LSD1的表达情况。 结果： 一、压力负荷型心肌肥厚模型大鼠心肌LSD1表达变化 心率和血压结果显示，与Control组和Sham组相比，TAC组动物心率、血压均明显升高，而Control组的心率血压高于Sham组（n=6，*p＜0.05、***p＜0.0001）。 超声心动结果显示，与Control组和Sham组相比，TAC组心肌出现明显肥厚，室壁厚度明显增加(LVPW及LVM显著增加)，心室腔缩小(LVID缩小)，EF升高、FS升高（n=6，***P＜0.001、**P＜0.01）。 心脏表型和心重比结果显示，与Control组和Sham组相比，TAC组大鼠心脏明显增大，心重比显著升高，具有统计学意义（n=6，***p＜0.0001）。 HE染色发现，与Control组和Sham组相比，TAC组心肌出现明显肥厚，心肌细胞截面积明显增大。 心肌组织三种肥厚因子表达：qPCR结果显示，与Control组和Sham组相比，TAC组大鼠心肌组织肌球蛋白轻链-2v（Myosin Light Chain2v,MLC-2V)、α-型肌红素重链(Alpha myosin Heavy chain,α-MHC)、心房利钠肽(Atrial Natriuretic Peptide,ANP）mRNA表达均明显上调（n=6，**p＜0.01、***p＜0.001）。 心肌组织LSD1及下游组蛋白表达：qPCR、Western Blot、免疫组化研究表明，与Control组和Sham组相比，TAC组大鼠心肌组织mRNA、蛋白表达水平均显著下降（n=6，p＜0.01），而进一步检测发现TAC组大鼠心肌组蛋白H3第4位赖氨酸一甲基化修饰（H3K4me1），H3K4me2，H3K9me1，H3K9me2的水平明显上调（n=6，**p＜0.01、***p＜0.001p＜0.01）. 二、构建LSD1过表达及去甲基化作用缺失质粒结果 Western Blot与实时定量PCR检测结果显示，与空白对照组相比，LSD1过表达组和LSD1去甲基化活性中心缺失组HEK293T细胞中LSD1蛋白及mRNA的相对表达量均显著上调（p＜0.01）。 结论： 1.LSD1与压力负荷型心肌肥厚的发生有关，持久的压力负荷可能通过抑制LSD1表达、增加组蛋白甲基化的状态而导致心肌肥厚。 2.成功构建了大鼠LSD1过表达质粒以及LSD1去甲基化活性中心缺失质粒，并在HEK293T细胞中实现过表达，为进一步研究LSD1去甲基化作用与相关疾病的关系奠定了基础。

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