黄连解毒汤通过改善肠道激素及肠道菌群延缓IGT大鼠2型糖尿病的发生机制

摘要

目的：
　　随着生活方式的改变、社会老龄化的不断进展，糖尿病发病率不断提高。如何有效预防及延缓其发病已成为医疗卫生工作的重中之重。革兰氏阴性菌细胞壁成分之一——脂多糖（LPS）水平在血浆内的升高（内毒素血症），已被证实与2型糖尿病（T2DM）慢性炎症反应息息相关，而肠道激素、肠道菌群及肠道黏膜屏障在T2DM发病中的地位也逐渐得到重视。本研究选用瘦素受体突变而自发2型糖尿病大鼠——ZDF大鼠（Zucker Diabetic Fatty rat，fa/fa），于糖耐量减退阶段（IGT）进行药物干预，以观察黄连解毒汤对糖耐量减退ZDF大鼠2型糖尿病发病的预防和（或）延缓作用并探讨相关机制。
　　方法：
　　SPF级雄性ZDF大鼠20只，以高脂饲料Purina＃5008诱导至IGT期后，随机分组至模型组或黄连解毒汤干预组（黄连组），每组各10只，并以正常ZL（Zucker Lean rats，fa/+）大鼠5只作为正常组对照。其中，黄连组以黄连解毒汤0.075g/d灌胃干预，模型组及正常组以同体积双蒸水对照，每周行口服糖耐量实验（OGTT）确定大鼠患病情况，以模型组全部发展至糖尿病为实验终点，再次行OGTT比较各组糖尿病发病率。实验过程中，每周记录大鼠血糖、体重、进食量等一般情况变化，留取糖耐量正常期（NGT）、IGT期及T2DM各时期血，以酶联免疫吸附法（ELISA）测定血浆胰岛素（INS）、胰高血糖素（GC）、脂多糖（LPS）、胰高血糖素样肽-1（GLP-1）及胰高血糖素样肽-2（GLP-2）等水平，并以HOMA-IR指数评价胰岛素抵抗；测定大鼠血脂水平、肝肾功以检测黄连解毒汤对血脂改善情况并评估药物副作用。留取各时期各组大鼠新鲜粪便标本，以16SrDNA高通量测序方法观察肠道菌群结构的改变。实验结束后处死动物留取新鲜肠道组织，评价大鼠肠道L细胞分泌GLP-1、GLP-2能力，观察光镜下各组肠道黏膜形态改变情况，以免疫组化方法观察不同组间回肠occludin、ZO-1、TLR-4、NF-κB和TNF-α的表达。
　　结果：
　　1.糖尿病发病率：对6周龄各组大鼠予高脂饲料Purina#5008诱导饲养后，ZDF大鼠于9周龄左右全部发展至糖耐量减退阶段（IGT），12周龄（药物干预3周）时，全部模型组大鼠发展为糖尿病（DM），而此时黄连组大鼠仅有50%进展为DM，另有50%的大鼠糖耐量恢复正常。
　　2.一般情况：药物干预开始后，各时期黄连组体重均低于对照组（P均<0.05）；干预2周后，黄连组大鼠进食量显著下降（P均<0.05）；药物干预3周后，与模型组相比，黄连组空腹血糖及糖耐量各时点血糖显著降低（P均<0.01）。
　　3. ELISA测定血浆各指标水平：随病程进展，ZDF大鼠空腹血浆胰高血糖素（P<0.01）、胰岛素抵抗水平（P<0.01）、LPS水平（P<0.05）、GLP-1（P<0.01）水平逐渐升高，而胰岛素、GLP-2（P均<0.01）水平逐渐下降。药物干预3周后，与模型组相比，黄连组空腹血浆胰岛素水平（P<0.05）、胰岛素抵抗水平（P<0.01）、胰高血糖素水平（P<0.05）、脂多糖水平（P<0.01）均有不同程度下降， GLP-1（P<0.05）水平进一步增加，而空腹血浆GLP-2水平未见明显改变。
　　4.肠道L细胞分泌GLP-1、GLP-2能力：药物干预3周后，较正常组，模型组及黄连组肠道L细胞分泌GLP-1能力明显提高，黄连组更为明显（P均<0.05）；而模型组肠道分泌GLP-2水平较正常组有所下降，黄连组对肠道L细胞分泌GLP-2能力具有改善作用。
　　5. HE染色观察肠道黏膜形态：糖尿病大鼠肠道黏膜形态破坏，可见肠绒毛排列杂乱、形态不规则增宽及融合，较多炎细胞浸润于固有层；黄连解毒汤干预组大鼠肠道黏膜形态有所改善。
　　6.免疫组化：与正常组相比，模型组回肠TLR-4、NF-κB和TNF-α（P均<0.01）的表达增加，回肠occludin及ZO-1（P均<0.01）表达明显减少；而黄连组上述指标均有明显改善（P均<0.01）。
　　7.16SrDNA高通量测序观察肠道菌群结构变化：
　　1）各干预组内粪便样本间具有高度相似性，而各组间肠道菌群结构具有明显差别（P<0.05）；
　　2）较正常组，模型组肠道菌群丰度及物种多样性均出现显著下降，黄连解毒汤对此有显著改善作用（P均<0.05）；
　　3）在门的水平，各组大鼠肠道菌群主要组成成分均为拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes），其次为变形菌门（Proteobacteria）与疣微菌门（Verrucomicrobia）。与正常组相比，糖尿病大鼠肠道菌群中拟杆菌门的相对丰度显著增加，而厚壁菌门相对丰度则相对减少；于IGT期对大鼠应用黄连解毒汤干预3周后，这一趋势得到有效遏制。在属水平，药物干预使肠道菌群中拟杆菌属（Bacteroides）、颤螺菌属（Oscillospira）、Akkermansia、凝聚杆菌属（Aggregatibacter）、梭菌属（Clostridium）、罗氏菌属（Roseburia）和真杆菌属（Eubacterium）相对丰度明显增加，而作为模型组肠道菌群主要成分的普雷沃菌属（Prevotella），在黄连组中比例显著减少。在种水平，与正常组相比，糖尿病大鼠粪便菌群中普氏菌（Prevotella copri）比例明显上升， Akkermansia_muciniphila、罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus_reuteri）和粪拟杆菌（Bacteroides_caccae）相对丰度显著下降，黄连解毒汤对肠道菌群结构明显改善。
　　8.生化指标检测：3周的黄连解毒汤干预对肝功能无明显影响（P>0.05）；与正常组相比，模型组与黄连组血尿素氮（BUN）升高（P<0.05）、血肌酐下降（P<0.01），黄连解毒汤有效降低了血尿酸（UA）水平,改善了血脂水平。
　　结论：
　　1.对6周龄ZDF大鼠予高脂饲料Purina#5008诱导饲养后，大鼠于9周龄左右发展至糖耐量减退阶段（IGT），12周龄时，发展为糖尿病（DM）。
　　2.于IGT阶段予黄连解毒汤干预，对ZDF大鼠有延缓T2DM发病的作用。可能机制有：
　　1）通过促进肠道L细胞GLP-1分泌，减少进食量，改善胰岛功能，减轻胰岛素抵抗；并降低肠道炎症，保护肠道黏膜屏障，减少LPS入血，降低机体慢性炎症反应水平；
　　2）显著升高糖尿病大鼠空腹血浆GLP-1水平，改善胰岛素抵抗及糖代谢紊乱；
　　3）通过促进肠道L细胞GLP-2分泌，减少肠道黏膜屏障损伤，减少LPS入血，降低机体慢性炎症反应水平；
　　4）通过改善肠道菌群结构，调整有益菌及致病菌比例，促进机体能量收支平衡；减少LPS生成，保护肠道黏膜屏障，降低机体慢性炎症反应水平。
　　3.黄连解毒汤干预未表现出明显的肝肾功毒副作用，并可改善糖尿病大鼠高脂血症。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

对象与方法

1.1.实验动物和饲养

1.2.主要试剂及仪器

1.3.实验方法

1.4.统计学处理

结果

2.1.对糖尿病的预防作用

2.2.脂多糖水平

2.3.对胰高血糖素样肽-1的影响

2.4对胰高血糖素样肽-2水平的影响

2.5.对肠道炎症及黏膜屏障的影响

2.6.对大鼠肠道菌群的影响

2.7.血脂及肝肾功情况

讨论

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:肠道菌群，肥胖与胰岛素抵抗

致谢

个人简历