B7.1/GM-CSF修饰的融合细胞抗前列腺癌的机制研究

摘要

目的：采用PEG融合技术将人前列腺癌细胞（PC3）和树突状细胞（DC）进行融合制造PC3-DC融合细胞，并应用B7.1/GM-CSF对融合细胞进行特定修饰，观察被特殊修饰的融合细胞的生物学效应及其在体外的特异性抗肿瘤免疫效应。
　　方法：1、GM-CSF及B7.1/GPI质粒的构建及B7.1/GPI蛋白的制备。运用Primer Premier软件设计GM-CSF、B7.1、B7.1胞外区、GPI引物，应用PCR、酶切、PCR连接、T连接获得PCDNA3.1-GM-CSF质粒及PCDNA3.1-B7.1/GPI质粒，转染于DH5a菌株中获得质粒的大量表达。应用康为转染试剂盒将PCDNA3.1-B7.1/GPI质粒和PSV2-DHFR质粒共转染入CHO/DHFR-细胞中，并培养于DMEM：F12=1：1的培养基中（10％胎牛血清、1×10-6mol/L G418），筛选出稳定表达B7.1/GPI的CHO细胞，于培养基中添加MTX进行加压筛选,每隔10日MTX的剂量翻倍一次，40日后保持MTX浓度不变，CHO细胞可以大量表达B7.1/GPI蛋白，应用western blot和免疫荧光验证CHO细胞中B7.1/GPI的表达。
　　2、B7.1/GM-CSF修饰的PC3-DC融合疫苗的制备及形态学观察。应用罗氏转染试剂盒将PCDNA3.1-GM-CSF质粒转染入PC3细胞中，通过G418筛选出稳定表达GM-CSF的PC3细胞，应用western blot和免疫荧光进行验证。通过淋巴细胞分离液从前列腺癌患者的外周血中分离出单个核细胞,并在含有rhGM-CSF（100 g/L）,rhIL-4（50 g/L）的DMEM培养基中培养7-9日，之后将DC置入流式细胞仪中进行检测。将前列腺癌患者的DC与GM-CSF-PC3细胞按照1：1比例重悬于RPM I1640培养基中，之后应用PEG将两种细胞进行融合，将其培养于含有500ng/ml GM-CSF的1640培养基中，在培养第14d后通过磁珠筛选技术筛选出所需要的融合细胞GM-CSF-PC3-DC以排除其他融合细胞的干扰。将所获得的融合细胞培养于RPMI1640培养基中，调整细胞浓度为5×106个/ml，并于培养基中加入B7.1/GPI蛋白（10ug/ml），于37°孵育4小时并间断震荡，之后将该细胞种于24孔板中培养，获得B7.1/GM-CSF-PC3-DC融合细胞，于锚定后12h，24h，48h，72h进行免疫荧光监测及流式分析，观察B7.1/GPI锚定于融合细胞表面后稳定的情况。
　　3、特定修饰的融合细胞的生物学特性和体外抗前列腺癌的能力。观察不同修饰情况下4组融合细胞的生长情况，了解4组融合细胞、DC组和PC3细胞的增值能力。比较4组融合细胞和DC组分别刺激T细胞增值能力和刺激T细胞分泌IFN-γ的能力的差异。通过LDH检测试剂盒检测4组融合细胞和DC组分别诱导CTL杀伤PC3细胞的能力。
　　结果：1、通过MTX加压筛选获得的CHO细胞能够大量表达B7.1/GPI蛋白，成功制备出表达GM-CSF的PC3细胞，成熟的DC高表达DC表面分子；PEG融合方法可有效的促进DC与PC3细胞的融合且磁珠筛选可有效筛选出融合细胞GM-CSF-PC3-DC。融合细胞高表达DC分子标记及前列腺癌标记。
　　2、在4组融合细胞中B7.1/GM-CSF-PC3-DC组刺激T细胞增值分泌IFN-γ的能力最强，其次为GM-CSF-PC3-DC组和B7.1-PC3-DC组，最差为PC3-DC组，但4组的能力均明显高于DC组（P<0.05）；通过LDH实验检测证明在4组融合细胞中B7.1/GM-CSF-PC3-DC组诱导CTL对PC3的杀伤的能力最强，其次为GM-CSF-PC3-DC组和B7.1-PC3-DC组，最差为PC3-DC组，但是均强于DC组（P<0.05）。
　　结论：1、构建的B7.1/GPI-CHO细胞大量表达B7.1/GPI蛋白，且获得的B7.1/GPI蛋白可稳定的锚定于融合细胞GM-CSF-PC3-DC表面；构建的GM-CSF-PC3细胞稳定的表达GM-CSF，PEG融合技术成功诱导DC与GM-CSF-PC3融合，磁珠筛选获得了较为纯净的融合细胞GM-CSF-PC3-DC；融合细胞高表达DC和PC3表面抗原。
　　2、与DC组相比，未经修饰的PC3-DC组融合疫苗刺激T细胞增值和分泌IFN-γ的能力更强，且未经修饰的PC3-DC组融合细胞诱导CTL效应细胞特异性杀伤PC3的能力也明显增强，而经B7.1/GM-CSF修饰后的融合疫苗组对T细胞增值和分泌IFN-γ的能力和诱导CTL效应细胞特异性杀伤PC3的能力均明显强于未经B7.1/GM-CSF修饰的融合细胞组。
　　3、PC3-DC融合疫苗具有明显的抗肿瘤免疫效应，而B7.1/GM-CSF作为一种特定修饰，可以显著提高融合细胞的抗肿瘤免疫效应，特定修饰的融合细胞可以成为一种新型有效的前列腺癌免疫治疗策略。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、B7.1/GM-CSF修饰的PC3-DC融合疫苗的制备及观察

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、特定修饰的融合疫苗的生物学特性及体外抗前列腺癌效应

2.1对象和方法

2.2结果

2.3讨论

小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:前列腺癌免疫治疗的前景与挑战

致谢

个人简历