伽马刀刺激血管内皮细胞加固未破裂的脑动脉瘤壁的实验研究

摘要

目的:培养人脑微血管内皮细胞(Human Brain Microvascular Endothelial Cells,HBMEC),通过细胞实验评价不同剂量伽马刀照射对人脑微血管内皮细胞活性及生物功能的影响,寻找促进人脑微血管内皮细胞活性的最佳照射剂量;而后建立动物颅内未破裂动脉瘤模型,并根据上述结果使用最佳照射剂量伽马刀对颅内未破裂动脉瘤动物模型中的动脉瘤进行照射治疗,观察伽马刀放射治疗对未破裂动脉瘤血管壁显微结构的影响. 方法:第一部分:培养人脑微血管内皮细胞,使用不同剂量(10Gy、15Gy、20Gy、25Gy)的伽玛刀照射处理人脑微血管内皮细胞,培养24小时后以细胞平板实验观察各组增殖情况,酶联免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)观察各组细胞上清中细胞分泌的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血小板衍生生长因子-β(Platelet derived growth factor,PDGF-β)以及转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的分泌水平,Western-blot检测各组人脑微血管内皮细胞内血小板衍生生长因子-β、转化生长因子-β1、血管内皮生长因子蛋白水平. 第二部分:雄性新西兰白兔40只,4个月龄,体重(2±0.2)kg,麻醉后以脱毛膏将颈部和股部毛脱去,消毒后仰卧位固定于造影手术床,从颈部中线做约5cm竖切口,向右分离筋膜肌肉等暴露右侧颈总动脉,向上暴露至颈内动脉、颈外动脉分叉上约1.0cm处,以缝合线在颈内动脉分叉上约0.5cm处结扎右侧颈内动脉,形成右侧颈内动脉长约0.5cm盲端,以湿纱布覆盖;暴露右侧股动脉,将股动脉远心端结扎,以traxcess0.014微导丝穿入股动脉,随后以微导管进入股动脉,上行通过髂总动脉、腹主动脉及主动脉弓、右侧颈总动脉,进入右侧颈内动脉盲端内,此时经导管向残端内注射15UI胰弹力蛋白酶,待20分钟充分反应撤出导管,依次缝合颈部和股部肌肉、皮肤,所有动物实验后放回笼中继续饲养,3周后造影观察动脉瘤模型制作是否成功. 第三部分:以上述方法建立颅内未破裂动脉瘤动物模型,3周造影时将动脉瘤制作成功的新西兰白兔随机分为A组(动脉瘤组,6只)、B组(动脉瘤+血管内导管介入栓塞组,6只),C组(动脉瘤+血管内导管介入栓塞+伽马刀放疗组,6只)、D组(动脉瘤+伽马刀放疗组,6只).其中B、C组分别在确认动脉瘤造模成功后随即造影下以弹簧圈栓塞,C、D组分别于造影证实动脉瘤造模成功(C组血管内导管介入栓塞)24小时内以15Gy剂量伽马刀对动脉瘤部位进行放射治疗,所有动物实验后放回笼中继续饲养,1月后留取动脉瘤部位血管标本,经4%多聚甲醛固定后行病理切片观察动脉瘤部位血小板衍生生长因子、转化生长因子-β1、血管内皮生长因子等蛋白表达情况. 结果:第一部分:经不同剂量伽马刀照射后,人脑微血管内皮细胞VEGF分泌水平出现明显改变:10Gy(1.64±0.13μg/L)、15Gy(1.61±0.17μg/L)剂量组照射后VEGF分泌水平显著高于对照组(1.56±0.21μg/L)及20Gy(1.57±0.18μg/L)、25Gy(1.43±0.11μg/L)剂量组(P<0.05),两组间差异无统计学意义;20Gy剂量组VEGF分泌水平与对照组相比未见明显差异,25Gy剂量组VEGF分泌水平低于对照组(P<0.05).人脑微血管内皮细胞PDGF-β分泌水平提示:不同伽马刀照射剂量组10Gy组(4.12±1.31μg/L)、15Gy组(4.04±1.02μg/L)及20Gy组(4.27±1.32μg/L)、25Gy组(4.13±1.22μg/L)剂量组与对照组(3.91±1.43μg/L)间差异无统计学意义(P>0.05),且各组间无统计学差异.人脑微血管内皮细胞TGF-β1分泌水平提示:不同伽马刀照射剂量组10Gy组(3.31±1.09μg/L)、15Gy组(3.61±0.98μg/L)及20Gy组(3.57±1.24μg/L)、25Gy组(3.43±0.97μg/L)剂量组与对照组间差异无统计学意义(P>0.05).Western-Blot结果可见,经不同剂量伽马刀照射后,人脑微血管内皮细胞内VEGF蛋白水平显著改变:10Gy组、15Gy组、20Gy组、25Gy组人脑微血管内皮细胞内VEGF蛋白水平较对照组显著增高(P<0.05),各不同照射剂量组间未见明显差异(P>0.05);人脑微血管内皮细胞内PDGFβ-1蛋白水平显著改变:10Gy组、15Gy组、20Gy组、25Gy剂量组细胞内PDGFβ-1蛋白水平较对照组显著增高(P<0.05),各不同照射剂量组组间未见明显差异(P>0.05);人脑微血管内皮细胞内TGF-β1蛋白水平显著改变:10Gy组、15Gy组、20Gy组、25Gy剂量组细胞内TGF-β1蛋白水平较对照组显著增高(P<0.05),不同伽马刀照射剂量组间未见明显统计学差异(P>0.05). 第二部分:通过结扎颈内动脉分叉上约0.5cm处形成残端,血管内介入的方法将胰弹力蛋白酶注射进入颈内动脉残端,使胰弹力蛋白酶与颈内动脉残端充分反应,20min后即可见颈内动脉残端血管壁变薄,颜色变浅.该造模方法简便,3周后复查造影确认成瘤率高(28/40,其中6只兔在实验造模早期由于操作不够熟练导致造模过程中死亡,6只在复查造影未见明显动脉瘤模型,经处死动物观察颈内动脉残端动脉瘤模型发现颈内动脉残端内血栓形成),所有动物造模后的饲养过程中无感染,无死亡. 第三部分:B、C组分别在动脉瘤造模成功后随即造影下以弹簧圈血管内导管介入栓塞,C、D组分别于造影确定动脉瘤造模成功后24小时内以15Gy剂量伽马刀对动脉瘤部位进行放射治疗.造影结果提示B、C组动脉瘤均可见动脉瘤经栓塞后未见明显动脉瘤残余,1月后所有实验动物处死留取动脉瘤模型组织(包括颈总动脉分叉、颈内动脉残端),行免疫组化检测动脉瘤模型部位VEGF、PDGF-β、TGF-β1表达情况,结果提示B、C、D三组动脉瘤血管壁内VEGF、PDGF-β、TGF-β1表达均显著高于A组,差异有统计学意义,其中C组动脉瘤血管壁内VEGF、PDGF-β、TGF-β1显著高于B组和D组,而B组和D组之间相比未见明显统计学差异. 结论:(1)伽马刀照射人脑微血管内皮细胞可以促进人脑微血管内皮细胞的增殖,提高细胞VEGF、PDGF-β、TGF-β1的合成,其中低剂量(10Gy、15Gy)伽马刀照射可以提高细胞VEGF分泌水平,而对PDGF-β、TGF-β1分泌的作用不明确.由于人脑微血管内皮细胞和VEGF、PDGF-β和TGF-β1在动脉瘤壁及动脉瘤超微结构中的重要性,推测低剂量伽马刀照射可以通过该病理过程来诱导动脉瘤结构的改变,进一步诱发动脉瘤血栓形成; (2)颈内动脉结扎+造影下注射胰弹力蛋白酶制作动物动脉瘤模型的方法较为安全简便,动脉瘤模型成瘤率高,制作过程中动物死亡率低,最终可获得体积、病理形态学与人类颅内动脉瘤极为相似的动脉瘤模型,模型制作过程操作简单,成瘤周期短(3周),动脉瘤成型过程稳定可靠,成瘤过程中动物死亡率低,术后动脉瘤通畅率好,模型制作费用低,可作为研究治疗脑动脉瘤和血管内导管介入栓塞材料的良好动物动脉瘤模型. (3)在兔动脉瘤模型中,血管内导管介入栓塞后24小时内给予伽马刀放疗可以提高动脉瘤壁细胞内PDGF-β、TGF-β1、VEGF等蛋白的水平,且明显高于单纯血管内导管介入栓塞组和单纯伽马刀放疗组,结合本研究第二部分可以得知,在动脉瘤动物模型中,一定剂量的伽马刀放射治疗可以提高血管壁中PDGF-β、TGF-β1、VEGF等蛋白表达含量,有助于提高动脉瘤血管壁的稳定性,降低再破裂出血的概率,对于治疗后存在动脉瘤残余的可以给予伽马刀放射治疗,提高参与动脉瘤的稳定性,降低再破裂出血风险,提高患者生存质量.

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