基于ITRAQ技术的“IGT肾病”尿液蛋白标志物研究

摘要

目的： 作为糖尿病的常见慢性并发症，糖尿病肾病（Diabetic nephropathy,DN）已成为导致终末期肾病的首位病因，一直是临床关注的焦点。糖尿病肾病之所以受到临床广泛关注，不仅是因为其患病率高，更主要的是缺乏有效的早期诊断和治疗手段。 微量白蛋白尿（MAU）是目前早期诊断DN的主要临床依据。但从临床预后转归看，MAU患者即使经过积极治疗多数也已失去治愈机会，10年中仅20-25%尿蛋白恢复正常，30-35%长期维持在MAU阶段，30-40%则逐渐进展至大量白蛋白尿。因此，有必要在更早期对糖尿病肾脏损伤做出诊断。潘长玉教授等调查发现，糖尿病前期患者有13.1%已经合并MAU。针对5000名毛利人和欧洲人群的调查发现，16%的糖耐量异常（IGT）患者合并MAU。因此，有必要在更早期的IGT阶段观察其肾脏损伤的发生情况。 前期在动物实验中发现，在IGT阶段尚未出现明显UMA升高时，即已出现不同程度的肾小管结构及功能受损，尿中反映肾小管损伤的指标：尿视黄醇结合蛋白（RBP）、N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶（NAG）和中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）等排泄增加。相对于DN,将在IGT期出现的肾脏损伤称为“IGT肾病”。“IGT肾病”概念的提出为DN的早期防治提供了新思路。那么，临床中糖耐量异常患者是否也存在“IGT肾病”？ 筛选糖尿病肾病早期诊断的新的生物标志物一直是临床关注的热点。有研究发现，尿中的一些生物标志物在尿微量白蛋白明显升高之前即已升高，主要包括转铁蛋白、IV型胶原、层粘连蛋白、粘多糖（GAGs）、免疫球蛋白G（IgG）及脂质运载蛋白型前列腺素D2合酶（L-PGDS）等。其中转铁蛋白、IgG、L-PGDS甚至能预测微量白蛋白尿的发生。那么，这些生物标志物在“IGT肾病”阶段是否会也出现明显变化值得进一步研究。 近年来，蛋白组学分析为糖尿病肾病的早期评估提供了新视角，糖尿病肾病发生发展涉及多种病理生理过程，因此目前尚未发现一种新的生物标志物能代替微量白蛋白尿用于预测糖尿病肾病的发病风险和早期诊断。相反，使用一组多个蛋白标志物来捕捉糖尿病肾病不同病理生理通路，预测糖尿病肾病的发生发展更具可行性。通过对正常个体及病理个体间的蛋白质组比较分析，可以找到某些“疾病特异性的蛋白质分子”，它们或许会为疾病的早期诊断提供早期依据。 因此，本研究拟在前期工作的基础上，进一步从临床角度验证IGT患者肾脏损伤的发生情况。同时利用目前广泛采用的蛋白组学技术-iTRAQ方法检测人群中不同糖耐量状态和不同肾脏损伤状态（正常对照者、IGT、IGT肾病、DM、DN）下的差异表达蛋白，为DN的更早期诊断提供更多依据。 方法：1.本研究将正常对照者、IGT、IGT肾病、DM及早期DN患者为研究对象，从临床角度进一步验证“IGT肾病”的发生情况，并比较目前已发现的对糖尿病肾病早期诊断有预测价值的尿液生物标志物（转铁蛋白、IV型胶原、层粘连蛋白、L-FABP、MCP-1及L-PGDS）在上述不同人群中的变化特点； 2.利用尿蛋白质组学研究在上述各组人群中的蛋白表达变化，探寻反映IGT患者肾脏损伤的新的生物标志物，评估其敏感性、特异性及对早期肾病的诊断价值，为“IGT肾病”的早期筛查和诊断提供理论参考。 结果：1.血糖和胰岛素比较：与正常对照组相比，IGT和“IGT肾病”组餐后2小时血糖升高（P＜0.05）；与正常对照组、IGT组相比，“IGT肾病”、T2DM组餐后2小时胰岛素升高（P＜0.05）；各组间胰岛素抵抗指数（HOMO-IR）逐渐升高，与NC、IGT、“IGT肾病”相比，2型DM和DN组HOMO-IR升高（P＜0.05）。 2.与正常对照组相比，“IGT肾病”组患者尿液中反应肾小球损伤的指标（微量白蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白G）和反应肾小管损伤的指标（NAG、RBP、GAL、NGAL和胱抑素C）均升高（P＜0.05）。 3.糖尿病肾病早期诊断标志物中，尿液中的TGF-β、MCP-1、CTGF均可以作为DN的诊断指标，其中TGF-β的诊断价值最高，但上述3种标志物在“IGT肾病”未见明显差异；与正常对照组相比，IGT肾病患者尿液中层粘连蛋白（LN）、高分子量脂联素（HMW-ADP），肝型脂肪酸结合蛋白（L-FABP）、IV型胶原明显升高（P＜0.05），其中LN、L-FABP、IV型胶原在正常对照组、IGT组、DN组呈现明显递增的趋势（P均＜0.05） 4.通过ITRAQ发现了28种在正常对照组、IGT组、“IGT肾病”组、DM组、DN组之间尿液中的差异表达蛋白，Pathway分析显示差异蛋白质可能通过PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、细胞吞噬作用（Phagosome）、胞吞作用（Endocytosis）、细胞粘附分子相互作用（Cell adhesion molecules）等信号通路参与“IGT肾病”的发病机制。 5.将差异明显的表达蛋白在扩大样本量后进行了验证，其中验证结果一致且差异最为明显的蛋白为环核苷酸阳离子通路α3（CNGA3）。CNGA3在正常对照组、“IGT肾病组”、DN组中表达明显依次降低，ELSA的结果与ITRAQ的结果一致，而免疫组化及Western-blot则显示在IGT期、DM期糖尿病大鼠的肾脏组织中CNGA3表达明显增加（P＜0.05）。 结论：1.从临床角度进一步验证了“IGT肾病”。“IGT肾病”患者已出现不同程度肾小球和肾小管损伤。肾小球损伤主要表现为尿液微量白蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白G的升高；肾小管损伤主要表现为NAG、RBP、GAL、NGAL和胱抑素C的升高。 2.已知可用于糖尿病肾病早期诊断的生物标志物中，“IGT肾病”患者尿液中层粘连蛋白（LN）、高分子量脂联素（HMW-ADP），肝型脂肪酸结合蛋白（L-FABP）、IV型胶原明显升高。 3.胰岛素抵抗及高胰岛素血症与“IGT肾病”发病密切相关。 4.在“IGT肾病”期出现多种表达差异的蛋白质，差异蛋白的生物学进程显示：差异蛋白质可能通过PI3K-Akt信号通路、细胞吞噬作用、胞吞作用、细胞粘附分子相互作用等信号通路参与“IGT肾病”的发病机制。 5.尿液中的CNGA3在IGT肾病组、DN组明显降低，可能是“IGT肾病”早期的生物标志物。

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