中期因子对甲状腺癌转移预测的临床价值及靶点治疗实验研究

摘要

目的：血清中期因子（midkine，MK）在多种恶性肿瘤中呈高表达，对肿瘤的发生、发展等发挥重要生物学作用。有关MK在甲状腺癌中研究报道较少，本文旨在探讨MK对甲状腺乳头状癌转移的预测价值；抑制MK在未分化甲状腺癌细胞（ARO）中的表达，研究其对细胞凋亡、增殖的影响及相关机制。 方法：（1）回顾性分析2011年1月至2015年1月在天津医科大学总医院核医学科接受131I治疗的并且至少随访2年的241例术后甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）患者。通过酶联免疫吸附法测定PTC患者首次131I治疗前及其后10-12个月时血清MK浓度，根据首次131I治疗后10-12个月时血清MK及促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)刺激状态下甲状腺球蛋白(thyroglobulin，Tg)浓度与首次131I治疗时比较将PTC患者分为3组，统计分析血清MK及Tg对PTC患者转移风险的预测价值；（2）通过蛋白免疫印迹（Western blotting）法检测甲状腺癌及癌旁组织、甲状腺癌细胞系（FRO、ARO、WRO、KTC及TPC）中的MK表达水平；将5种MK特异性siRNA采用脂质体转染法转染未分化型甲状腺癌（anaplastic thyroid cancer，ATC）细胞（ARO细胞），下调细胞中MK表达，同时检测MAPK和PI3K两条通路关键蛋白ERK1/2和Akt磷酸化水平及下游凋亡相关蛋白caspase-3和survivin的表达变化；设置不同浓度梯度MK-siRNA-3转染ARO细胞，通过细胞MTT试验观察MK下调对于细胞增殖的影响。 结果：(1)241例患者在行首次131I治疗之前至少1月，已行甲状腺全切或甲状腺次全切术和（或）颈部淋巴结清扫术，术后病理诊断证实为PTC且癌灶大小及淋巴结转移分区明确。首次131I治疗后的10-12个月时TSH刺激状态下Tg降低（与首次131I治疗前TSH刺激状态下Tg相比），但未达到理想Tg水平（TSH刺激状态下Tg低于1.0ng/ml），PTC患者发生转移的风险是Tg降至理想水平的12.5倍（P＜0.01）。当Tg增加（与首次131I治疗前TSH刺激状态下Tg相比），PTC患者发生转移的风险是Tg降至理想水平的19.5倍（P＜0.01）。首次131I治疗后的10-12个月时血清MK水平下降（与首次131I治疗前血清MK相比），但未达到普遍接受的正常水平(255.01±126.78pg/ml)，PTC患者发生转移的风险是血清MK降至普遍接受的正常水平(255.01±126.78pg/ml)的3.0倍（P＜0.01）。当血清MK水平增加（与首次131I治疗前血清MK相比），则发生转移风险是血清MK降至普遍接受的正常水平(255.01±126.78pg/ml)的5.0倍（P＜0.01）。在第3组患者中，无病生存率显著低于其它任何两组。（2）Western blotting结果显示甲状腺癌组织及癌旁正常组织中均见MK表达，且MK在甲状腺癌组织中表达明显高于癌旁组织（5.51倍）；在甲状腺癌5个细胞系（FRO、ARO、WRO、KTC及TPC）中，甲状腺癌细胞系ARO、WRO、KTC中MK呈高表达，且MK在ARO中的表达高于WRO及KTC，而甲状腺癌细胞系FRO及TPC中未见明显MK表达。针对MK的5种特异性siRNA（工作浓度为50nM）作用于ARO细胞48小时后，均能有效抑制ARO细胞中MK的表达；siRNA转染ARO细胞72小时后，siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4均可抑制PI3K通路中Akt的磷酸化水平，并下调下游抗凋亡蛋白Survivin、上调促凋亡蛋白Caspase-3水平，差异有统计学意义（p＜0.05）；对于MAPK通路，只有siRNA-4处理组抑制Erk1/2磷酸化水平（p＜0.05）。siRNA-3转染ARO细胞作用24小时后细胞存活实验显示，在MK-siRNA-3浓度高于500nM时，具有抑制甲状腺癌细胞增殖的作用。 结论：监测血清MK动态变化对PTC患者发生转移风险的预测具有潜在的临床价值。MK在甲状腺癌中高表达，通过抑制MK的表达，可影响MAPK及PI3K通路的磷酸化及凋亡相关蛋白水平，并可抑制细胞增殖。

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