SDPR在乳腺癌发生发展中发挥的作用及机制

摘要

背景： 乳腺癌是全球妇女最常见的恶性肿瘤之一，也是妇女尤其是中老年妇女所患癌症相关疾病的第二大病因，如今乳腺癌的发病率仍然处于很高的水平。近年来，医疗技术的改进降低了乳腺癌的死亡率，但是乳腺癌的防治仍然是临床医生面临的重要研究课题。然而，乳腺癌发生发展的具体机制尚不完全了解，导致其针对性较强的治疗方法比较少，进而导致了乳腺癌患者的生存率依然处于较低的水平。 血清剥夺反应因子（Serum Deprivation Response，SDPR），又被称为Caveolae Associated Protein2（Cavin-2），其编码基因位于2号染色体，q32-q33的位置，具有编码纯化血小板磷脂结合蛋白（PS-P68）的功能，并且首次从人的血小板中作为一种磷脂酰丝氨酸（PS）结合蛋白被纯化出来，同时其在血清饥饿的细胞中表达水平上调。目前，SDPR已经被认为是蛋白激酶C（protein kinase C-PKC）磷酸化的一种关键底物，SDPR的中间结构可以与PKC的调节域相结合，在缺乏SDPR-PKC相互作用的细胞中，发现细胞的定位和底物的特异性发生了明显的改变，两者之间的相互作用决定了PKC与小窝（caveolae）之间的关系。小窝是细胞质膜向内凹陷而形成的一种特化的囊状结构，其主要功能是参与跨膜物质的转运，并且作为细胞信号分子富集以及信号转导的枢纽，影响细胞株的增殖、迁移和侵袭能力，此外，小窝是钙离子通道，它和肠道生理起搏作用密切相关。最近的研究表明，SDPR在多种肿瘤中表达下调，提示SDPR可能作为一种潜在的抑癌基因。然而，SDPR在乳腺癌的发生发展过程中所发挥的具体作用及机制尚不清楚。 目的与方法： 1.通过RT-qPCR检测30例乳腺癌组织及配对的癌旁正常乳腺组织中SDPR的mRNA表达水平。采用Cancer Genome Atlas肿瘤基因组图谱（TCGA）中的表达谱数据分析标准化SDPR的mRNA表达水平，通过GOBO数据库数据使用Kaplan-Meier生存分析法，分析不同SDPR表达水平乳腺癌患者无病生存率，了解SDPR在乳腺癌组织及正常乳腺组织中的表达差异情况。 2.通过Western blot检测不同乳腺癌细胞中SDPR的表达水平，进一步通过构建SDPR过表达质粒或siRNAs，转染乳腺癌细胞后，通过MTT、细胞克隆形成、EDU细胞实验、Transwell、流式细胞术等评价SDPR表达水平对乳腺癌细胞生物学行为的影响。 3.通过RT-qPCR、Western blot、流式细胞术、细胞形态学观察等评价SDPR对乳腺癌EMT的影响，通过RT-qPCR、MTT、细胞克隆形成、EDU细胞实验、Transwell等评价TGF-β的抑制剂SB431542对乳腺癌细胞EMT样表型的影响。 4.通过荧光素酶实验、ELISA、免疫荧光染色、MTT、细胞克隆形成、EDU细胞实验、Transwell、RT-qPCR、Western blot、流式细胞术等评价SDPR对TGF-β信号通路的影响。 结果： 1.在30例乳腺癌组织样本以及乳腺癌旁正常组织样本中，有29例乳腺癌组织样本中SDPR的mRNA表达水平明显低于癌旁组织。TCGA数据库数据显示，乳腺癌组织中SDPR的mRNA表达水平明显低于正常乳腺组织。GOBO数据库数据显示，SDPR低表达与乳腺癌患者预后较差相关。 2.选取SDPR表达水平最高的MCF-10A细胞株以及SDPR表达水平最低的MDA-MB-231细胞株作为后续研究对象，通过在MDA-MB-231中转染SDPR过表达质粒及在MCF10A中转染siRNAs抑制SDPR的表达，证明了SDPR可以抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力，并且促进细胞凋亡。 3.SDPR可以上调上皮标记物E-cadherin和β-catenin，下调间充质标记物vimentin和N-cadherin的表达，抑制乳腺癌细胞发生EMT，并且影响细胞周期及细胞形态，此外，TGF-β的抑制剂SB431542可以抑制乳腺癌细胞的EMT样表型。 4.过表达SDPR后加入TGF-β1可以恢复乳腺癌细胞EMT样表型，此外，干扰SDPR表达可以提高TGF-β1的表达水平，激活TGF-β信号通路，诱导乳腺癌发生EMT，并且在加入抑制剂SB431542后得到抑制。 结论： 本研究证实SDPR在乳腺癌组织中表达下调，SDPR低表达与乳腺癌患者较差预后相关。SDPR通过阻断TGF-β信号通路，抑制乳腺癌细胞EMT表型，进而抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭能力，并诱导乳腺癌细胞凋亡。

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Abstract

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、SDPR在乳腺癌中的表达下调

1.1 对象和方法

1.1.1 研究对象

1.1.1.1 细胞

1.1.1.2 组织

1.1.1.3 数据库

1.1.2 实验材料

1.1.2.1 实验试剂与实验材料

1.1.2.2 实验仪器与实验设备

1.1.2.3 实验主要试剂的配制

1.1.3 实验方法

1.1.3.1 组织、细胞RNA提取

1.1.3.2 RNA逆转录为cDNA

1.1.3.3 实时定量PCR实验

1.1.3.4 细胞培养、复苏与冻存

1.1.3.5 Western-blot实验

1.1.4 统计学方法

1.2 结果

1.2.1 SDPR在乳腺癌患者的癌组织中低表达

1.2.2 乳腺癌患者中SDPR高表达水平组的DFS值较高

1.2.3 SDPR在乳腺癌中表达水平降低

1.3 讨论

1.3.1 SDPR在乳腺癌患者的癌组织中低表达

1.3.2 SDPR的表达水平与乳腺癌患者预后相关

1.3.3 SDPR在乳腺癌中表达水平降低

1.4 小结

二、SDPR抑制乳腺癌细胞增殖与侵袭

2.1 对象和方法

2.1.1 研究对象

2.1.2 实验材料

2.1.2.1 实验试剂与实验材料

2.1.2.2 实验仪器与实验设备

2.1.2.3 实验主要试剂的配制

2.1.3 实验方法

2.1.3.1 过表达pcDNA3.1-SDPR-HA质粒的构建

2.1.3.2 si-SDPR质粒的构建

2.1.3.3 转染

2.1.3.4 Western-blot实验

2.1.3.5 细胞培养、复苏、冻存与传代

2.1.3.6 MTT实验

2.1.3.7 细胞克隆形成实验

2.1.3.8 EdU细胞实验

2.1.3.9 Transwell细胞侵袭实验

2.1.3.10 细胞凋亡实验

2.1.4 统计学方法

2.2 结果

2.2.1 过表达SDPR抑制MDA-MB-231的增殖及侵袭能力

2.2.2 干扰SDPR的表达增强MCF10A的增殖及侵袭能力

2.3 讨论

2.3.1 过表达SDPR抑制MDA-MB-231的增殖及侵袭能力

2.3.2 干扰SDPR的表达增强MCF10A的增殖及侵袭能力

2.4 小结

三、SDPR抑制乳腺癌细胞发生EMT，并促使细胞G1期阻滞

3.1 对象和方法

3.1.1 研究对象

3.1.2 实验材料

3.1.2.1 实验试剂与实验材料

3.1.2.2 实验仪器与实验设备

3.1.2.3 实验主要试剂的配制

3.1.3 实验方法

3.1.3.1 细胞培养、复苏、冻存与传代

3.1.3.2 细胞RNA提取以及逆转为cDNA

3.1.3.3 实时定量PCR实验

3.1.3.4 Western-blot实验

3.1.3.5 细胞周期实验

3.1.4 统计学方法

3.2 结果

3.2.1 SDPR可以影响乳腺癌细胞形态

3.2.2 SDPR调控EMT分子标志物的表达水平

3.2.3 SDPR促使乳腺癌细胞G1期阻滞，并调控细胞周期相关因子表达

3.3 讨论

3.3.1 SDPR对乳腺癌细胞形态的影响

3.3.2 SDPR抑制乳腺癌细胞的EMT样表型

3.3.3 SDPR调控乳腺癌细胞周期及细胞周期相关因子的表达水平

3.4 小结

四、SDPR诱导激活TGF-β信号传导通路

4.1 对象和方法

4.1.1 研究对象

4.1.2 实验材料

4.1.2.1 实验试剂与实验材料

4.1.2.2 实验仪器与实验设备

4.1.2.3 实验主要试剂的配制

4.1.3 实验方法

4.1.3.1 ELISA实验

4.1.3.2 荧光素酶实验

4.1.3.3 细胞免疫荧光实验

4.1.3.4 Western-blot实验

4.1.3.5 MTT实验

4.1.3.6 细胞克隆形成实验

4.1.3.7 EdU细胞实验

4.1.3.8 Transwell细胞侵袭实验

4.1.3.9 细胞周期实验

4.1.3.10 实时定量PCR实验

4.1.4 统计学方法

4.2 结果

4.2.1 TGF-β抑制剂SB431542对乳腺癌细胞的影响

4.2.2 干扰SDPR的表达可以诱导激活TGF-β信号转导通路

4.2.3 TGF-β可以恢复乳腺癌细胞受到SDPR抑制的EMT样表型

4.3 讨论

4.3.1 TGF-β抑制剂SB431542对乳腺癌细胞的影响

4.3.2 干扰SDPR的表达可以诱导激活TGF-β信号转导通路

4.3.3 TGF-β可以恢复乳腺癌细胞受到SDPR抑制的EMT样表型

4.4 小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述

关于Cavin-2/SDPR基因的研究进展

综述参考文献

致谢

个人简历