Notch1通路经CXCR4介导促进胶质瘤起始细胞的侵袭迁移和自我更新能力

摘要

胶质瘤是最为常见的中枢神经系统原发恶性肿瘤，约占所有中枢神经系统肿瘤的27%，约占颅内恶性肿瘤的80%，是人类最难治性肿瘤之一[1]。尽管近年来，手术结合同步放化疗的治疗策略使患者预后有所改善，但最新的美国脑肿瘤注册中心（central brain tumorregistryof the united states,CBTRUS）显示胶质母细胞瘤的五年生存率仍仅为5.5%，肿瘤内部复杂的不均一性是导致其对各种理化因素的抵抗并进展复发的关键[2]。胶质瘤起始细胞（glioma initiating cells,GICs）是一群具有自我更新、无限增殖、多向分化潜能的肿瘤细胞，他们常常分布于肿瘤坏死区、微血管周围以及肿瘤组织边缘，被认为是肿瘤进展和复发的“主角”[3]。因此，胶质瘤干细胞的自我更新、侵袭迁移等生物学行为及其在胶质瘤发生发展中的作用成为了目前的研究热点。 近来的研究发现，Notch1信号通路在胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)中高度激活，Notch1信号通路被发现在调控胶质瘤干细胞的增殖、干性维持、分化等行为中发挥着重要作用[4]，不同于传统的依靠游离性配体与细胞表面受体结合的方式激活细胞信号通路，Notch通路的配体与受体均为细胞表面跨膜蛋白，只有通过受体配体细胞相互接触，才能实现配体与受体的结合而启动Notch信号[5]。当Notch通路激活后，γ-分泌酶将发挥水解作用，使Notch胞内域（Notch intracellular domain,NICD）被切割并进入细胞核与转录因子CBF1结合，活化下游包括Hes和Hey家族靶基因表达，从而调节细胞的生物学行为[6]。在非小细胞型肺癌、前列腺癌、乳腺癌等肿瘤中均已发现Notch通路可以通过诱导肿瘤细胞表型的上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT），增强其迁移和侵袭能力[8-10]。在人脑肿瘤中，Notch通路呈异常激活，并且主要富集于肿瘤干细胞中，并调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和迁移等生物学行为[7]。然而，对于Notch信号通路调控胶质瘤干细胞生物学行为的具体机制目前尚未研究清楚。 趋化因子受体4（C-X-C chemokine receptor type4，CXCR4）因被用来提取纯化艾滋病毒的几个趋化因子受体而被认识，近来研究发现，CXCR4在多种肿瘤细胞中表达，在胶质瘤细胞中CXCR4也有表达并与肿瘤级别相关，随着胶质瘤恶性程度的增高，CXCR4的表达水平也相应升高，并与患者的生存预后相关[11]。有研究指出相对于低表达CXCR4的胶质瘤病人，高表达CXCR4的胶质瘤病人在放化疗后有更高的复发几率，预后更差[12]。CXCR4可以与其特异性的配体基质细胞衍生因子（Stromal cell-derived factor1，SDF-1）又称为趋化因子受体（C-X-C motif chemokine12，CXCL12）结合，他们在恶性胶质瘤细胞的趋化迁移及血管生成中发挥着极为重要的作用。相对于普通培养的胶质瘤细胞，CXCR4被发现在GSCs中高度激活，一方面CXCR4可以促进侵袭性伪足形成及基质金属蛋白的分泌来促进胶质瘤细胞的侵袭迁移，另一方面CXCR4也可通过PI3k/AKT、ERK等信号通路调控编码胶质瘤干细胞的增殖、干性维持及侵袭迁移等基因的转录。胶质瘤干细胞还可以通过自分泌或旁分泌CXCL12来维持自身干性及增殖状态[13]。 本课题前期研究发现Notch1信号通路分子与CXCR4在胶质母细胞瘤组织标本中具有共表达趋势，它们在蛋白水平的表达均随着胶质瘤病理级别的增高而增高，而针对胶质瘤细胞系（包括胶质瘤传统细胞系、胶质瘤起始细胞系）mRNA表达谱也发现，相对于胶质瘤传统细胞系，Notch1和CXCR4均在胶质瘤干细胞中富集，提示在胶质瘤干细胞中Notch1和CXCR4可能存在着Crosstalk共同调控着胶质瘤干细胞的生物学行为。 本课题主要研究Notch1信号通路在胶质瘤起始细胞自我更新和侵袭运动中的作用及其潜在的调节机制，研究分为以下四个部分： 1.Notch1信号通路分子在胶质母细胞瘤中的表达及与预后关系。基因表达谱交互分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）在线基因分析Notch1在不同系统肿瘤与对照组织中的mRNA表达比，我们发现相对于其他系统肿瘤，Notch1在GBM中显著高表达；生物信息学提取从Oncomine数据库平台Bredel Brain2和Sun BrainmRNA数据分析并再次验证Notch1在对照脑组织及胶质母细胞瘤组织中的表达差异；生物信息学提取胶质瘤TCGA mRNA及临床资料数据库分析发现Hes1表达与胶质瘤病人预后相关；GEO数据库采集Notch1和CXCR4在胶质瘤干细胞系及传统细胞系中的mRNA表达谱，结果显示Notch1和CXCR4在均在GICs中富集，并具有共表达趋势。 2.Notch1对胶质瘤起始细胞侵袭迁移、自我更新能力的影响。我们利用慢病毒转染，建立了Notch1蛋白稳定低表达的胶质瘤细胞系。用干细胞培养基诱导的方法获得胶质瘤细胞球，并利用免疫磁珠分进一步选出CD133+的胶质瘤细胞。通过Transwell侵袭迁移试验、荧光基质胶降解试验证实Notch1对胶质瘤起始细胞侵袭迁移能力的促进作用。通过细胞球形成试验、体外极限稀释试验证实了Notch1对于胶质瘤起始细胞自我更新能力具有维持作用。 3.Notch1通过CXCR4介导调控AKT/mToR通路影响胶质瘤起始细胞侵袭迁移、自我更新能力。通过Western blot发现敲低Notch1可以下调Hes1、CXCR4、pAKT、pmTOR的蛋白水平的表达，证明了CXCR4和AKT是Notch1通路的下游。随后添加CXCL12与对照组相比Notch1、Hes1蛋白无明显变化，而p-AKT、p-mTOR蛋白表达明显增加，提示在胶质瘤起始细胞中，CXCL12/CXCR4趋化因子系统是Notch1信号通路的下游，它的激活可以提高下游AKT/mTOR信号通路的活性。 4.体内实验验证Notch1通过CXCR4调控胶质瘤起始细胞侵袭迁移能力。将不同处理组（shNC组、sh1组和sh2组）的胶质瘤起始细胞分别进行裸鼠鼠脑原位种植，观察并记录荷瘤鼠饲养过程中的体重、生存期等指标。利用小动物活体成像仪通过荷瘤鼠肿瘤细胞生物发光的信号强弱来观察肿瘤生长大小。免疫组织化学染色观察不同处理组组织标本中Notch1、CXCR4、pAKT等蛋白表达变化。HE（苏木素伊红）染色观察肿瘤组织与正常脑组织交界处边缘形态。统计不同处理组小鼠体重、生存时间变化是否具有差异。结果显示：敲低Notch1可以显著地减缓肿瘤生长速度，改善小鼠预后，在体内微环境中，Notch1-CXCR4-AKT轴性通路仍然存在。 结论： 1.Notch1信号通路在胶质母细胞瘤中高度激活，Notch1在胶质瘤起始细胞中高表达。 2.Notch1可以调控胶质瘤起始细胞的侵袭迁移及自我更新能力。 3.Notch1通过CXCR4介导作用于AKT/mTOR通路调控胶质瘤起始细胞的侵袭迁移及自我更新能力。 4.体内实验验证Notch1通过CXCR4介导促进胶质瘤起始细胞生长及侵袭迁移能力。

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