miR-26a靶向ITGβ8调控JAK2/STAT3信号通路促进肺癌细胞转移的作用机制研究

摘要

目的： 肺癌是全球范围内癌症新发病例和死亡病例较多的恶性肿瘤之一。肺癌极易发生转移，预后差，接受治疗后5年生存率不足1/3。大约80%的肺癌为非小细胞肺癌。miRNAs是一类由20-22个碱基组成的小RNA，它们参与包括肺癌在内的许多恶性肿瘤的转录后基因调控。已有研究报道miR-26a可以影响肿瘤细胞的侵袭和转移，但miR-26a对肺癌细胞的影响及作用机制尚不明确。本文致力于明确miR-26a对肺癌细胞体内外的增殖能力和侵袭转移能力的影响，并阐明其作用机制，进而为肺癌的诊断及临床治疗提供依据。 方法： 1.运用瞬时转染的方法，在非小细胞肺癌细胞系A549、H1299和H661中过表达或降表达miR-26a，然后通过CCK-8、划痕实验、Transwell实验确定miR-26a对NSCLC细胞的增殖和侵袭转移能力的影响。 2.使用生物信息学软件对miR-26a的靶基因进行分析预测，拟定ITGβ8作为miR-26a作用的靶点。通过构建ITGβ8的3’-UTR区荧光质粒，采用双荧光素酶报告基因实验和Western Blot方法分别从mRNA水平和蛋白水平验证ITGβ8是否为miR-26a的靶基因。 3.对NSCLC细胞系A549、H1299和H661中ITGβ8进行过表达和降表达，采用划痕实验和Transwell实验研究ITGβ8对NSCLC细胞A549、H1299和H661迁移侵袭的影响。 4.运用RT-PCR方法检测10个肺癌组织临床样本中ITGβ8和miR-26a的相对含量，并利用SPSS进行基因相关性分析；对NSCLC细胞系A549、H1299和H661中ITGβ8进行过表达，检测miR-26a的相对含量，确定ITGβ8对miR-26a是否具有负反馈调节作用。 5.运用RT-PCR和Western Blot方法检测转移相关基因（CD44和MMP-9）及EMT相关蛋白（E-cadherin和Snail）的转录或表达水平，从而确定miR-26a对肿瘤转移相关基因及EMT相关蛋白的影响。采用Western Blot方法检测JAK2/STAT3通路中相关蛋白的表达水平，探究miR-26a调节NSCLC细胞迁移侵袭能力的分子机制。 6.利用慢病毒包装系统构建miR Control和miR-26a的A549表达细胞系，经嘌呤霉素药物筛选得到A549-miR-Control-luc和A549-miR-26a-luc稳定表达细胞系。用以上稳定表达细胞系建立裸鼠皮下肿瘤模型，运用活体成像体统对原位瘤及转移瘤进行实时检测，研究miR-26a对体内肺生长及转移的影响。采用Western Blot方法检测JAK2/STAT3通路中相关蛋白的表达水平，明确miR-26a影响肺癌生长和转移的分子机制。 结果： 1.miR-26a对NSCLC细胞系A549、H1299、H661的增殖没有显著提高，然而明显促进肺癌细胞迁移侵袭能力。 2.ITGβ8是miR-26a的靶基因。 3.ITGβ8可以抑制NSCLC细胞系A549、H1299、H661的侵袭和转移，miR-26a和ITGβ8过表达质粒共转染的结果表明ITGβ8可以部分削弱miR-26a促进NSCLC细胞侵袭迁移的能力。 4.ITGβ8是miR-26a的作用靶基因。在肺癌组织标本中，miR-26a的水平和ITGβ8的水平成负相关性；在NSCLC细胞中，ITGβ8过表达可以负反馈调控miR-26a的表达。 5.miR-26a可以提高NSCLC细胞系A549、H1299、H661中转移相关基因CD44和MMP-9的转录水平；增加E-cadherin和Snail的表达进而促进NSCLC细胞的EMT。miR-26a增强JAK2/STAT3通路中p-JAK2、p-STAT3、MMP-2蛋白的表达，激活JAK2/STAT3信号通路，促进NSCLC细胞的转移。进一步研究显示靶基因ITGβ8介导miR-26a促进NSCLC细胞转移的作用。 6.体内研究表明，miR-26a促进裸鼠体内肿瘤的生长和转移。机制研究显示，miR-26a调控转移相关基因MMP-2和C-myc，激活JAK2/STAT3信号通路。 结论： 1.miR-26a促进NSCLC细胞体外的侵袭迁移，同时促进NSCLC细胞的体内生长及转移。 2.ITGβ8是miR-26a的靶基因。ITGβ8介导了miR-26a促进NSCLC细胞侵袭转移的作用。 3.机制研究显示，miR-26a通过调控转移相关基因，促进NSCLC细胞发生上皮间质转化，激活JAK2/STAT3信号通路，促进NSCLC细胞侵袭转移。 4.miR-26a有望成为肺癌侵袭转移的治疗新靶点。

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