miR-26a靶向GSK-3β调控β-catenin信号通路增强肺癌细胞转移潜能的机制研究

摘要

肺癌，尤其是非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC）在世界范围内是造成肿瘤相关性死亡最常见的原因，据WHO统计2013年约占男性肿瘤死亡的28％，女性的26%。肺癌发病患者当中，非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌患者总数的75%-80%，主要包括三种病理组织学类型，分别为肺腺癌（Adenocarcinoma, CA）、肺鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma, SCC）和大细胞癌（large-cell carcinoma, LCC）。据2008年全球肿瘤统计，肺癌是临床诊断最常见的癌症，在男性癌症相关死亡原因中居首位。在女性中，肺癌是第四个最常见的诊断癌症和第二大肿瘤相关死亡原因。在所有这些肺癌患者中处于疾病进展期或已经发生转移的病例高达65%以上。侵袭转移已经成为肿瘤治疗失败的重要原因，是肿瘤治疗亟需解决的关键难题之一。microRNAs（miRNAs）是一类长度大约由19-25个核苷酸构成的非编码小分子 RNA，目前研究发现它可以通过多种生物学机制调节靶基因的表达，但microRNAs发挥作用的具体机制目前仍不十分清楚。microRNA最初被作为基因附属物被发现，最终认为它是基因组的重要组成部分被命名为微小RNA基因组，它们被认为是人类基因组中未被探明的黑暗神秘物质。作为新的非编码RNA库中的成员，microRNAs通过与靶基因mRNA的3’-UTR（Untranslated Region）域结合，从而使靶基因降解或者抑制转录后翻译来影响靶蛋白的表达。microRNAs异常表达已经在很多肿瘤中被发现，包括在肺癌组织等。近年来许多研究表明，microRNAs与肿瘤的侵袭转移有关。一些功能性研究发现miR-26a在肿瘤的发生发展中有重要作用,并取得了一定的研究进展。在本实验研究中，我们进一步探讨了 miR-26a靶向调控GSK-3β通过β-catenin信号通路对肺癌细胞侵袭转移潜能的影响。
　　前期研究中我们应用实时荧光定量PCR技术检测发现miR-26a在肺癌细胞系中的表达水平较正常支气管上皮细胞系降低，在肺原位癌组织和肺淋巴转移癌组织中较正常肺组织表达降低，但肺淋巴转移癌组织较原位肺癌组织表达增高。进而应用划痕和Transwell小室实验检测了miRNA-26a靶向PTEN通过AKT通路促进肺癌细胞侵袭迁移。应用细胞活力计数分析实验检测了 miR-26a对肺癌细胞增殖活力无影响。因为miRNA功能涉及多个基因多条通路的复杂性，为了进一步了解 miR-26a对肺癌侵袭转移的功能，本实验中我们采用生物信息学软件预测了miR-26a潜在的靶基因GSK-3β，进而应用荧光素酶报告基因实验验证了miR-26a靶向于GSK-3β基因的3’-UTR区，Western-blot法检测miR-26a靶向抑制 GSK-3β的蛋白表达。最后应用蛋白印迹 Western-blot法检测了 GSK-3β下游靶蛋白β-catenin的表达变化，检测了miR-26a作用于GSK-3β进而对β-catenin发生核内转位和侵袭转移相关基因C-myc/Cyclin D1表达变化的影响。
　　综合我们的数据显示 miR-26a在肺癌组织中较癌旁正常组织中表达下调（***P<0.001），差异具有统计学意义。miR-26a在肺癌淋巴结转移组织中的表达水平高于原发肺癌组织（**p<0.01），差异有统计学意义。通过对细胞增殖活力分析实验研究表明转染100nM和200nM miR-26a模拟物对肺癌细胞增殖没有影响。侵袭转移功能性实验划痕和小室实验研究证实：通过瞬时转染法将miR-26a模拟物和抑制剂转染肺癌细胞，结果显示miR-26a的表达水平能够显著影响癌细胞的侵袭转移能力，过表达 miR-26a促进肺癌细胞的侵袭转移，抑制miR-26a的表达降低肺癌细胞的侵袭转移能力。物信息学软件初步预测GSK-3β是miR-26a的直接作用靶点，进一步荧光素酶报告基因实验及Western-blot法证实GSK-3β是miR-26a的直接靶点。分子机制研究揭示miR-26a增强GSK-3β的磷酸化水平，降低GSK-3β总蛋白的表达水平，进而上调β-catenin的表达，并促进β-catenin蛋白向肺癌细胞核内转移，从而激活WNT/β-catenin信号通路。我们还检测了miR-26a对β-catenin信号通路的下游调控基因C-myc、Cyclin D1的表达变化。Western-blot法和Real-time PCR法的结果证实miR-26a促进侵袭转移相关基因C-myc、Cyclin D1、β-catenin、MMP-2、VEGF、Twist等表达上调。
　　本研究揭示了 miR-26a促进肺癌侵袭转移的新机制，即通过调控其靶基因GSK-3β，促进β-catenin表达及核内转位，进而激活Wnt/β-catenin信号通路，影响下游侵袭转移相关基因 C-myc、CyclinD1的表达，功能性研究也更加清晰的表明 miRNA-26a通过靶向 GSK-3β增强肺癌细胞侵袭转移潜能。以上研究为miR-26a作为肿瘤侵袭转移的治疗靶点奠定了基础，后续研究将通过动物体内模型对其作用及其机制进行深入研究。

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缩略语/符号说明

前言

研究现状及目的

实验设计路线图

研究内容和拟解决的关键问题

第一部分：实验材料和实验仪器

1.实验材料：

2.实验仪器：

第二部分：课题组前期工作

1. miR-26a在肺癌组织及肺癌细胞系中的表达

2. miR-26a对肺癌细胞增殖及侵袭转移的功能性影响

3. miR-26a对侵袭转移相关基因的影响

4.讨论

第三部分：miR-26a靶点GSK-3β 的预测及验证

1. miR-26a作用靶点的预测

2. miR-26a靶向GSK-3β 荧光素酶报告基因试验

3. miR-26a调控GSK-3β 蛋白表达变化

4. 讨论

第四部分：miR-26a 靶向 GSK-3β调控β -catenin 信号通路促进肺癌细胞侵袭转移潜能的机制研究

1. miR-26a靶向GSK-3β调控β -catenin蛋白表达

2. miR-26a调控β -catenin蛋白核转位的研究

3. miR-26a调控β -catenin通路转移相关基因C-myc/Cyclin D1的研究

4. miR-26a靶向GSK-3β 促进肺癌细胞侵袭转移

5.讨论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:MicroRNA调控肿瘤耐药的研究进展

致谢