雄激素受体与MTA1、HDAC6在ER阴性乳腺癌中的相互作用

摘要

目的： 在雌激素受体（estrogen receptor，ER）阴性乳腺癌细胞系中探究雄激素受体（androgen receptor，AR）、人类表皮生长因子2（HER2）、转移相关蛋白1（metastasis-associated protein-1，MTA1）三者之间是否存在相互影响，以及MTA1对乳腺癌细胞增殖侵袭的影响，并且在动物体内验证三者之间的关系。同时探究AR与组蛋白脱乙酰酶6(histone deacetylase6,HDAC6)之间的关系，以及HDAC6对乳腺癌患者预后的影响。 方法： 1.利用Q-RT-PCR和Western-blot检测三种ER阴性细胞系（MDA-MB-453、MDA-MB-231和SK-BR-3）中AR、HER2的表达情况，免疫荧光观察MTA1在细胞中的定位情况。 2.选择ER阴性的乳腺癌细胞，转染MTA1的下调质粒，利用MTT实验观察细胞的增殖能力，利用划痕实验观察细胞的迁徙能力。 3.选取HER2阳性的乳腺癌细胞系，转染AR过表达的和干扰后的质粒，利用Q-RT-PCR和Western-blot观察HER2的表达情况；选取AR阳性的乳腺癌细胞系，转染HER2过表达的和干扰后的稳系，利用Q-RT-PCR和Western-blot观察HER2的表达情况。 4.选取ER阴性HER2阳性的乳腺癌细胞系，转染AR过表达的质粒，通过Q-RT-PCR和Western-blot检测MTA1的表达情况，同时选取HER2阴性的乳腺癌细胞系作为对照组，观察MTA1的变化，为了进一步证实实验的可靠性，选取AR/HER2阳性的细胞系，人为干扰掉HER2后上调AR，观察MTA1的变化。 5.选取ER阴性AR、HER2均阳性的细胞系，转染MTA1干扰后，利用Q-RT-PCR和Western-blot观察AR和HER2的表达情况，证实是否三者之间存在相互作用。 6.将稳转过AR过表达病毒的细胞系皮下注射到裸鼠体内，同时将转染过空白对照病毒的同种细胞系注射到对照组裸鼠体内，每组5只老鼠，培养28天后取出裸鼠的肿瘤组织，提取mRNA，Q-RT-PCR观察MTA1的表达情况，同时取出裸鼠肝肺组织，进行HE染色观察是否有癌细胞转移。 7.随机选取230例乳腺癌组织进行HDAC6，AR免疫组织化学染色，分析HDAC6，AR在乳腺癌中的表达情况，用统计软件SPSS19.0分析二者和临床病理指标之间的关系，以及二者的相互关系，通过对230例乳腺癌患者进行电话随访和病例回顾分析HDAC6，AR对患者预后的影响。 8.将ER阴性的乳腺癌筛选出来成为一个亚组，在ER阴性的亚组中分析HDAC6和AR的表达情况，用统计软件SPSS19.0分析二者和临床病理指标之间的关系，以及二者的相互关系，分析HDAC6和AR对乳腺癌预后的影响。将230例乳腺癌分成分子大汗腺组和非分子大汗腺组，比较两组的预后情况，在分子大汗腺组中分析HDAC6对预后的影响。 结果： 1.Q-RT-PCR和Western-blot实验结果均显示MDA-MB-453的细胞表型为AR+/HER2+，SK-BR-3的细胞表型为AR-/HER2+，MDA-MB-231的细胞表型为AR-/HER2-；免疫荧光结果显示MTA1在三种乳腺癌细胞系中的定位都是在细胞核。 2.MTT结果显示下调MTA1的细胞与空白对照组相比增殖能力明显下降，划痕实验结果表明下调MTA1的细胞与对照组相比迁徙能力明显下降。 3.在SK-BR-3和MDA-MB-453细胞系中上调AR，Q-RT-PCR和Western-blot结果显示两种细胞系的HER2表达均升高；反之，下调AR后，HER2表达均降低；继续在MDA-MB-453细胞系中上调HER2,实验结果发现AR也随之表达量增加；下调HER2，AR表达量随之下降。 4.在SK-BR-3和MDA-MB-453细胞系中上调AR，Q-RT-PCR和Western-blot结果显示两种细胞系的MTA1表达均升高，而在MDA-MB-231细胞系中，MTA1表达没有变化；继续在MDA-MB-453细胞系中干扰掉HER2后上调AR,结果发现干扰HER2后再上调AR的细胞中的MTA1表达水平与空白对照组无差异。 5.在MDA-MB-453细胞系中，下调MTA1，Q-RT-PCR和Western-blot结果显示AR和HER2的表达量均下调。 6.体内实验结果表明AR能够促进肿瘤细胞的增长，Q-RT-PCR实验结果发现皮下注射稳定转染稳转AR过表达的MDA-MB-453细胞系的裸鼠内的肿瘤提取的mRNA中，MTA1的表达水平明显高于对照组，同时将10只小鼠的肝肺取出，进行HE染色，镜下观察是实验组小鼠有两例发生了癌细胞的肺转移，对照组小鼠均为发现癌细胞转移。 7.通过对230例组织切片的免疫组化结果分析，HDAC6在乳腺癌中的表达位置既可以在细胞浆，也可以在细胞核，AR表达的阳性率为67%HDAC6在乳腺癌中的表达率为58.8%，spearman分析结果显示两者存在相关性。而二者对228例乳腺癌患者的预后都没有影响。 8.在98例ER阴性的乳腺癌中，AR和HDAC6表达显著相关，高表达的HDAC6在ER阴性组的乳腺癌中预后更差，将228例乳腺癌分为分子大汗腺型乳腺癌和非分子大汗腺型乳腺癌，结果显示分子大汗腺型乳腺癌的预后更差，而高表达的HDAC6在分子大汗腺型乳腺癌中也代表着更差的预后。 结论： 在ER阴性的乳腺癌中，通过上下调AR与HER2发现，AR与HER2之间存在相互作用，而AR与HER2均可以影响MTA1的表达，但是这种影响需要两者共同参与，缺少两者之一，都不能使MTA1发生改变。MTA1能够影响乳腺癌的发生发展，增强癌细胞的转移和侵袭能力。了解MTA1的调节机制有望为乳腺癌的治疗提供新的治疗靶点；而在MTA1参与的NuRD复合物中的另一重要蛋白HDACs家族中成员HDAC6也与AR存在联系，并且在ER阴性的乳腺癌中表达的更佳频繁，HDAC6的高表达代表更差的预后，HDAC6与AR的联合拮抗很有可能成为乳腺癌治疗的新靶点，总之AR作用机制复杂，并在乳腺癌的发生发展中起到重要作用。

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