LEO对不同糖浓度下Streptococcus mutans产酸及调节机制的影响

摘要

目的：探讨柠檬精油(Lemon essential oil,LEO)对不同葡萄糖浓度下变异链球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）产酸及其调节机制的影响，为LEO在口腔疾病防治中的应用提供理论依据。 方法：1.最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）的测定 采用液体稀释法测定LEO对0%、0.2%、1%和5%葡萄糖浓度下S.mutans的最小抑菌浓度。 2.产酸实验 根据测得的MIC,分别用0%、0.2%、1%和5%糖浓度的TPY培养基对LEO对倍稀释，每种糖浓度下设置4个稀释浓度，每个稀释浓度设置3个重复，不含LEO的培养基（四种糖浓度）作为对照组。检测各组含S.mutans溶液的初始pH值，37℃下厌氧培养24h，再次检测各组样本的pH值，以ΔpH=pH最终-pH初始来反映LEO对不同糖浓度下S.mutans的产酸能力的影响。 3.乳酸脱氢酶活性的测定 分组方法同实验2。收集培养18h的S.mutans，冰浴下超声破碎菌体，BCA蛋白定量试剂盒测定各个样本的蛋白质浓度，还原性辅酶Ⅰ氧化法测定各样本乳酸脱氢酶的活性。 4.ldh基因转录和翻译量的测定 实验分组设计同实验2，每种糖浓度下仅设置3个稀释浓度。将S.mutans加入各组中，37℃下厌氧培养18h后，提取S.mutans的总RNA，逆转录合成cDNA，PCR扩增，确定各组S.mutans ldh基因转录量。 分别用0%和1%糖浓度的TPY培养基对1×MIC的LEO对倍稀释，每种糖浓度下设置3个稀释浓度，每个稀释浓度设置3个重复，不含LEO的培养基（0%和1%糖浓度）作为对照组。将S.mutans加入各组培养基中，37℃下厌氧培养18h后，采用SDS-PAGE测定ldh基因的翻译量。 结果：1．MIC测定结果：LEO在0%和5%糖浓度下的MIC为1.125mg/ml，在0.2%和1%糖浓度下的MIC为2.25mg/ml。 2.LEO对0%、0.2%、1%和5%糖浓度下S.mutans产酸的影响结果 （1）对照组S.mutans产酸的影响结果 在对照组，随着葡萄糖浓度的升高（0.2%~5%糖浓度），培养基的ΔpH值逐渐增大，均高于0%糖浓度组，差异均具有统计学意义（F=1913.266,P＜0.05），说明高浓度葡萄糖更有利于S.mutans产酸。 （2）LEO对S.mutans的产酸影响结果 在无糖（0%糖浓度）环境下，仅MIC组ΔpH值低于对照组，差异具有统计学意义（F=12.953，P＜0.05），提示在无糖环境下，亚抑菌浓度的LEO对S.mutans的产酸无影响。 在有糖（0.2%~5%糖浓度）环境下，随着LEO浓度的升高，各糖浓度下S.mutans的ΔpH值逐渐降低，除0.563mg/ml（0.2%糖浓度1/4MIC）以下浓度外，所有LEO组的ΔpH值均低于相同糖浓度下的对照组，差异具有统计学意义（F0.2%=197.287，F1%=2229.371，F5%=2603.091，P＜0.05），提示在一定浓度范围内，亚抑菌浓度的LEO对高糖、中糖和低糖环境下的S.mutans产酸均有抑制作用，作用具有浓度依赖性。 3．LEO对0%、0.2%、1%和5%糖浓度下S.mutans乳酸脱氢酶活性的影响结果 （1）对照组S.mutans的乳酸脱氢酶活性的影响结果 在对照组，随着葡萄糖浓度的升高（0.2%~5%糖浓度），S.mutans的乳酸脱氢酶活性逐渐增大，均高于0%糖浓度组，差异均具有统计学意义（F=335.297,P＜0.05），提示高浓度的葡萄糖更有利于S.mutans乳酸脱氢酶活性的提高。 （2）LEO对S.mutans的乳酸脱氢酶活性的影响结果 在无糖（0%糖浓度）环境下，随着LEO浓度的升高，实验组的乳酸脱氢酶活性逐渐降低，各组的乳酸脱氢酶活性均低于对照组，差异均有统计学意义（F0%=60.85，P＜0.05），提示LEO在无糖环境下可以抑制S.mutans乳酸脱氢酶活性，抑制作用呈现浓度依赖性。 在有糖（0.2%~5%糖浓度）环境下，随着LEO浓度的升高，各糖浓度下S.mutans的乳酸脱氢酶活性均逐渐降低，除0.141mg/ml（0.2%糖浓度1/16MIC）外，实验组的乳酸脱氢酶活性均低于相同糖浓度下的对照组，差异均有统计学意义（F0.2%=78.867，F1%=77.071，F5%=255.594，P＜0.05），提示在低糖、中糖和高糖环境下，亚抑菌浓度的LEO也可以抑制S.mutans乳酸脱氢酶活性，抑制作用具有浓度依赖性。 4.LEO对0%、0.2%、1%和5%糖浓度下S.mutans ldh基因转录和翻译的影响 （1）对照组S.mutans ldh的基因转录结果 在对照组，随着葡萄糖浓度的升高（0.2%~5%糖浓度），1%和5%糖浓度组S.mutans的ldh基因的转录量高于0%糖浓度组，差异具有统计学意义（F=16.151，P＜0.05），提示在一定糖浓度下（1%和5%）的葡萄糖可以诱导S.mutans ldh基因的表达上调。 （2）LEO对S.mutans ldh基因转录和翻译的影响结果 在无糖环境下（0%糖浓度），各实验组ldh的基因转录量均高于对照组，与对照组相比，差异均具有统计学意义（F=14.258，P＜0.05）；0.563mg/ml（1/2MIC）精油组的ldh基因的翻译量低于对照组，0.282mg/ml（1/4MIC）精油组的ldh基因的翻译量高于对照组，相比对照组，差异具有统计学意义（F=167.193，P＜0.05），提示在无糖环境下，LEO可能有诱导ldh基因转录上调的作用，对ldh基因翻译具有一定的影响，作用无明显规律。 在有糖环境下，除0.563mg/ml（0.2%糖浓度1/4MIC）外，其余实验组ldh的基因转录量均低于对照组，差异均有统计学意义（F0.2%=18.009，F1%=316.667，F5%=36.528，P＜0.05）；实验组的ldh基因合成乳酸脱氢酶的量显著低于对照组，差异具有统计学意义（F1%=709.001，P＜0.05），提示在有糖环境下，LEO可以抑制ldh基因的转录和翻译。 结论：1、LEO可以抑制0%、0.2%、1%和5%糖浓度下S.mutans产酸。 2、在有糖环境下，亚抑菌浓度的LEO在不影响细菌生长的同时，可以通过抑制S.mutans ldh基因的转录和翻译，降低乳酸脱氢酶的活性，进而减少酸的产生。 3、在无糖环境下，亚抑菌浓度的LEO对S.mutans ldh基因的转录可能具有逆调节的作用，对S.mutans ldh基因的翻译具有一定的影响，作用无显著规律。 4、高浓度的葡萄糖可以上调S.mutans ldh基因的表达量，提高乳酸脱氢酶的活性，更有利于产酸。 5、LEO对无糖环境下S.mutans ldh基因转录的逆调节作用需要从多角度进一步研究证实。

目录

第一个书签之前

3.1.1 实验材料 ……………………………………………………………29