蚯蚓超氧化物歧化酶理化性质及其提取条件的研究

摘要

本文以大平二号蚯蚓为原料，对其体内超氧化物歧化酶的理化性质以及提取条件进行了研究，得出以下几点结论： 1．蚯蚓在自然清水中排出体内泥砂需要24h左右，而采用5％硫酸钠和9％硫酸镁处理可使蚯蚓排砂时间分别缩短到18min和30min，提高SOD活性分别为27.2％和27％。 2．在蚯蚓SOD提取过程中外加铜、锌离子可使酶活性提高。单独加铜离子时最适浓度为0.5mmol·L<'-1>，可以提高蚯蚓SOD活性17.0％；单独加锌离子处理时最适浓度为0.04mmol·L<'-1>，提高蚯蚓SOD活性为16.0％；以0.04mmol·L<'-1>锌离子浓度和0.33mmol·L<'-1>铜离子浓度配合，为提高蚯蚓SOD活性的最佳浓度配比，能提高蚯蚓SOD活性19.6％。铜、锌离子处理的SOD同工酶谱分析表明：铜、锌离子处理只提高各同工酶的活性，不影响其带数。 3．温度、pH、提取液体积对蚯蚓SOD活性均有一定的影响。蚯蚓SOD是一种热稳定性很高的酶，35～40℃表现出最高活性，50℃后酶活性降低到最高活性的62.2％；同工酶分析表明50℃后使SOD部分同工酶失活。SOD对pH值变化也是比较稳定的酶类，蚯蚓SOD的最适pH值为7.8～8.2；SOD同工酶分析表明：pH主要影响SOD同工酶的活性，只在pH9.0时有部分同工酶带的丢失。提取蚯蚓SOD的最适提取液体积为蚯蚓鲜重的4倍(ml／g)。 4．通过不同硫酸铵饱和度沉淀蚯蚓SOD研究发现：蚯蚓SOD活性主要集中在60～90％硫酸铵饱和度范围内；这段范围沉淀出的SOD粗产品比活为229.6(U／mg)，产率为55.1％。 5．通过不同浓度丙酮对蚯蚓SOD沉淀研究发现：蚯蚓SOD活性主要集中在丙酮浓度0.7～1.2V范围内，这段丙酮浓度范围提取出的SOD粗产品比酶活为132.1(U／mg)，产率为64.9％，其SOD同工酶分析表明：丙酮沉淀所得产品中含有蚯蚓原液同工酶6条中的5条。 6．对丙酮和硫酸铵沉淀分离的蚯蚓SOD产品进行。POD同工酶分析表明：所得SOD粗产品中不含有过氧化物酶(POD)。

目录

致谢

摘要

第一章前言

1.1氧自由基

1.2超氧化物歧化酶对超氧离子自由基的清除

1.3影响蚯蚓SOD提取的主要因素

1.4SOD提取所采用的一般生化方法

1.5蚯蚓的研究背景

1.6本研究的目的和意义

第二章材料与方法

2.1实验材料和试剂

2.2实验方法

2.2.1蚯蚓超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定

2.2.2可溶性蛋白含量的测定

2.2.3硫酸钠促进蚯蚓排砂的处理

2.2.4硫酸镁促进蚯蚓排砂的处理

2.2.5为提高蚯蚓SOD活性的加铜处理

2.2.6为提高蚯蚓SOD活性的加锌处理

2.2.7铜、锌离子对蚯蚓SOD活性影响的最适比例

2.2.8蚯蚓SOD在不同温度下的处理

2.2.9蚯蚓SOD在不同pH值下的处理

2.2.10不同提取液体积下的蚯蚓SOD产率

2.2.11不同硫酸铵饱和度对蚯蚓SOD的沉淀

2.2.12硫酸铵纯化蚯蚓SOD的过程

2.2.13不同硫酸铵饱和度的SOD同工酶和蛋白质的电泳分析

2.2.14不同浓度丙酮沉淀蚯蚓SOD的探求

2.2.15丙酮沉淀、纯化蚯蚓SOD的实验步骤

2.2.16丙酮沉淀的SOD同工酶分析

2.2.17蚯蚓提取液的蛋白质凝胶电泳分析（PAGE）

2.2.18超氧化物歧化酶（SOD）染色方法

2.2.19过氧化物酶（POD）染色方法

2.2.20统计学方法

第三章结果与分析

3.1.1硫酸钠对蚯蚓排砂速度及其SOD活性的影响

3.1.2硫酸镁对蚯蚓排砂速度及其SOD活性的影响

3.1.3铜离子浓度对蚯蚓SOD活性的影响

3.1.4锌离子浓度对蚯蚓SOD活性的影响

3.1.5铜、锌离子最适比例的探讨

3.1.6铜、锌离子处理对蚯蚓SOD同工酶的影响

3.1.7温度对蚯蚓SOD活性的影响

3.1.8温度对蚯蚓SOD同工酶的影响

3.1.9不同pH值对蚯蚓SOD活性的影响

3.1.10不同pH值对蚯蚓SOD同工酶的影响

3.2.1提取液体积对蚯蚓SOD产率的影响

3.2.2不同硫酸铵饱和度沉淀蚯蚓SOD的结果

3.2.350℃除去杂蛋白后，60～90%硫酸铵饱和度沉淀蚯蚓SOD的结果

3.2.4不同上样量对蚯蚓SOD同工酶的影响

3.2.5不同硫酸铵饱和度对蚯蚓SOD同工酶的影响

3.2.6不同硫酸铵饱和度的蚯蚓蛋白质电泳图谱分析

3.2.7不同丙酮浓度沉淀蚯蚓SOD的结果

3.2.8丙酮沉淀蚯蚓SOD的结果

3.2.9丙酮沉淀SOD粗产品

3.2.10丙酮沉淀SOD粗产品的同工酶谱

3.2.11SOD粗酶产品中过氧化物酶的检测

第四章结论

第五章展望

第六章参考文献

蚯蚓超氧化物歧化酶理化性质的研究