核糖体蛋白RPL15调节核糖体生物发生及其与结肠癌发生发展关系的研究

摘要

本文通过免疫荧光染色初步确定核糖体蛋白RPL15定位在细胞质、细胞核基质和核仁中，且呈点状分布。利用小分子干扰RNA将RPL15蛋白表达干涉后，核仁结构变得松散，推测RPL15蛋白参与核仁结构的维持;同时，用蔗糖密度梯度离心将核糖体大小亚基前体进行分离，发现RPL15的表达抑制导致60S大亚基前体的波峰下降，推测RPL15蛋白参与核糖体大亚基前体的装配。通过Oncomine数据库分析，发现RPL15蛋白与结肠癌相关。我们从细胞和组织水平分别进行验证。发现与非转化二倍体细胞RPE1相比，RPL15蛋白在多个结肠癌细胞中呈高表达;同时，在收集的25例临床样本中，与相应的正常癌旁组织相比，RPL15mRNA和蛋白在癌组织中高表达的有13例，低表达的有6例，其余6例中表达差异不明显，其表达量与结肠癌的TNM分期具有相关性。其后，利用MTT、BrdU融合实验、流式细胞术、AnnexinⅤ/PI及Western Blot实验检测，将RPL15表达干涉后，对RPE1及结肠癌细胞HCT116生长增殖的影响。发现干涉RPL15表达抑制了两种细胞的增殖，导致进入S期的细胞明显减少。但是在HCT116细胞中检测到明显的细胞凋亡。综上所述，核糖体蛋白RPL15参与核糖体大亚基前体的装配，在结肠癌细胞和组织中高表达，抑制该蛋白表达后可以特异性的杀伤HCT116细胞，暗示RPL15可以作为结肠癌诊断和治疗的的靶点，为以RPL15为靶点的结肠癌临床治疗奠定了理论基础。

目录

声明

摘要

第一章背景与立题依据

1．1结肠癌的研究现状

1．2核糖体的生物发生

1．2．1核糖体生物发生是多步骤的复杂调控过程

1．2．2核糖体生物发生是多蛋白参与的复杂调控过程

1．3核糖体生物发生的异常与多种人类疾病，特别是肿瘤的发生发展密切相关

1．4 RPs-HDM2-p53路径

1．5核糖体大亚基蛋白RPL15概述及功能

1．6研究目的和意义

第二章材料与方法

2．1实验材料与实验仪器

2．1．1细胞

2．1．2主要实验仪器

2．2实验试剂

2．2．1细胞培养基及转染试剂

2．2．2主要实验药品

2．2．3蛋白免疫印迹(Western Blot，WB)相关试剂的配制

2．2．4免疫荧光染色(Immunofluorescence，IF)相关试剂的配制

2．2．5细胞裂解液

2．2．6超速离心分离核糖体前体的溶液

2．2．7制备感受态细胞相关溶液的配制

2．3实验方法

2．3．1细胞培养

2．3．2细胞冻存

2．3．3细胞复苏

2．3．4感受态细胞制备

2．3．5质粒转化

2．3．6质粒提取

2．3．7质粒转染

2．3．8 siRNA转染

2．3．9 Western Blot实验

2．3．10细胞免疫荧光实验

2．3．11提取哺乳动物细胞核糖体前体的连续蔗糖密度梯度的建立

2．3．12哺乳动物细胞核糖体前体的提取

2．3．13核糖体前体丰度的确定

2．3．15 MTT实验

2．3．16 BrdU实验

2．3．17凋亡检测

2．3．18流式细胞术分析细胞周期

2．3．19核仁面积的统计方法

2．3．20统计：SPSS Statistics 17.0

2．3．21Trizol法提取RNA和蛋白质

2．3．22 Real-time PCR(实时荧光定量PCR)

第三章实验结果

3．2 RPL15定位在细胞质、细胞核基质和核仁部位

3．2．2外源性RPL15的亚细胞定位

3．2．3 RPL15与大亚基核糖体蛋白RPL11及小亚基核糖体蛋白RPS6共定位

3．3 RPL15蛋白在核糖体生物发生中的功能

3．3．1 RPL15蛋白参与维持核仁结构的完整性

3．3．2 RPL15调节核糖体大亚基前体的生物发生

3．4 RPL15与结肠癌发生发展具有相关性

3．4．1 oncomine数据库分析RPL15蛋白在结肠癌中高表达

3．4．3 RPL15蛋白在结肠癌组织中高表达

3．5 RPL15蛋白对结肠癌细胞增殖的影响

3．5．1 RPL15敲降抑制细胞的增殖能力

3．5．3 RPL15敲降引起结肠癌细胞凋亡

3．5．4明确RPL15调节细胞增殖的分子机制

第四章讨论

4．1核糖体蛋白RPL15的讨论

4．2核糖体蛋白功能的讨论

4．3核糖体蛋白与核仁结构完整性的讨论

4．4 RPL15蛋白可能是结肠癌预后标志蛋白的讨论

参考文献

致谢