胺基聚甲基丙烯酸甘油脂的合成及其作为胰岛素和寡聚核苷酸载体的应用

摘要

聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)具有良好的生物相容性，具有活性环氧基团。小分子胺基化合物能够与环氧基团发生开环反应，得到胺基聚甲基丙烯酸甘油酯(胺基PGOHMA)，同时生成可以与生物分子发生相互作用的氢键。作为药物载体的胺基PGOHMA具有如下特征：(1)胺基PGOHMA可以通过静电相互作用与胰岛素形成纳米复合体；(2)胺基PGOHMA通过静电和氢键的协同作用与反义寡聚核苷酸(AON)形成纳米复合体。由于氢键的协同作用，高分子可以在较低的N/P比例下与AON形成复合体，从而降低细胞毒性；而通过氢键作用结合的AON更容易在细胞内释放，从而提高基因转染效率。
　　 采用二元胺或多胺与PGMA反应合成了胺基化聚甲基丙烯酸甘油酯衍生物-胺基PGOHMAs(L-E，L-B，L-D，S8-E，S8-B，S8-D.其中L和S8分别代表线性和8臂聚合物；E，B，D分别代表乙二胺、丁二胺和二乙三胺)。胺基PGOHMAs能与胰岛素形成纳米复合体(PECs)。通过动态光散射研究了影响复合体形成的因素。在适当的条件下，比如介质pH值5.58-6.27、NaCl浓度为0.02 mol/L、胰岛素与聚合物的质量比为0.8时，能够得到粒径100-200 nm的纳米复合体。胰岛素结合率(AE)随纳米复合体电位的升高而增加。圆二色谱(CD)分析表明，冻干之后聚电解质纳米复合体保持原来的结构。傅里叶变换红外光谱(FT-IR)与X射线衍射(XRD)实验证明，胰岛素与胺基PGOHMAs之间存在弱相互作用，这种作用在复合体形成过程中起到了相当重要的作用。胰岛素的释放取决于胺基PGOHMAs的结构和组成。
　　 为了提高AON转染效率和降低其细胞毒性，用异丙胺(MEA)、2-氨基-1-丁醇(2-ABO)和4-氨基-1-丁醇(4-ABO)三种具有不同氨基的小分子对线性和星形(PGMA)进行修饰。在Tris缓冲溶液中，这些胺基PGOHMA能够在较低N/P(高分子中的氨基与AON中的磷酸基团)比(0.5-3)时与AON自组装形成100-300 nm的纳米复合体，并且粒径分布较窄(PDI值小于0.25)。当N/P比为1.5或者2.5时，胺基PGOHMA/AON复合体的Zeta电位从负值变为正值。使用原子力显微镜(AFM)可以直观的观察到这些复合体呈球形。使用凝胶电泳和zeta电位测试证实了在较低的N/P比时胺基高分子可以与AON形成纳米复合体。用溴化乙锭取代试验研究了复合体的稳定性。AON与胺基高分子形成复合体后可以避免脱氧核糖核酸酶I对AON的酶解作用。电荷比的增加和氢键的协同效应都有助于提高复合物的稳定性，从而阻止压缩的AON被核酸酶分解。使用COS-7细胞进行体外细胞毒性试验。除了具有较高分子量(30 kDa)的胺基PGOHMA具有较大的细胞毒性外，其它胺基PGOHMAs与PEI25k相比毒性较小。与PEI25k相比，MEA修饰的直链和星形PGOHMA(分子量在15-20kDa)，以及4-ABO修饰的直链PGOHMA具有更高的体外转染效率。实验结果表明：具有适当的氨基基团和分子量的胺基PGOHMAs可以作为AON的安全、有效载体。