过量合成核黄素的枯草芽孢杆菌的代谢工程

摘要

该论文根据代谢工程理论,重点研究了过量合成核黄素的枯草芽孢杆菌的基因工程及其碳代谢的全局调节机理,得到如下结果:B.subtilis 核黄素生物合成的限制因素不在于5-磷酸核酮糖及3-磷酸甘油酸等前体物的供给,也不是还原力NADPH的供给,而在于以鸟苷三磷酸为起始物的生物合成途径中核黄素操纵子的基因剂量及ATP的供给.用吖啶橙及提高培养温度法不能消除B.subtilis 24/pMX45中的质粒,SDS对B.subtilis 24/Pmx45 质粒的消除率为4.1﹪,原生质体再生法的质粒消除率为12﹪.以Pbe2为载体,所构建的带有4.6kb核黄素操纵子的重组质粒pRF46在E.coliHB101中成功表达.将SMMP高渗缓冲液中的Mg<'2+>用50mM的Ca<'2+>取代并将pH调至7,煮沸原生质体悬浮液1min,可降低B.subtilis24A7原生质体核酸酶活性.葡萄糖的吸收及磷酸化大多由B.subtilis基因ptsG编码的葡萄糖透性酶EII完成,分别编码EI与HPr的ptsl及ptsH形成组成型表达的操纵子.B.subtilis 的碳分解代谢阻遏受分解代谢调节蛋白A(CcpA)及具有顺式作用的分解代谢响应元件的调控.当葡萄糖浓度大于3﹪时,B.subtilis核黄素发酵出现葡萄糖分解代谢阻遏效应,并引起代谢流迁移.发酵液的低pH值抑制了核黄素合成酶的活性,核黄素产量增加缓慢.

目录

文摘

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前言

第一章文献综述

1.1核黄素的理化性质、功能和用途

1.2核黄素的生产现状及方法

1.2.1全化学合成法

1.2.2化学半合成法

1.2.3微生物发酵法

1.3核黄素的生物合成途径

1.4核黄素操纵子的结构

1.5核黄素操纵子结构基因所编码的酶的功能

1.6核黄素生物合成途径中的代谢调节机制

1.6.1前体物GTP合成的代谢调节机制

1.6.2由前体物GTP到核黄素的调节机制

1.7核黄素高产菌的育种思路和方法

1.7.1增加前体物的供给和利用

1.7.2切断其他代谢支路

1.7.3解除从GTP到核黄素合成途径中的代谢调节

1.8产核黄素基因工程菌构建的进展和国内外研究现状

1.9代谢工程

1.9.1代谢工程的研究工具

1.9.2代谢工程的应用

1.10本文主要研究内容

第二章过量合成核黄素的枯草芽孢杆菌的代谢通量分析

2.1方法

2.1.1 B.subtilis的生化反应网络

2.1.2 B.subtilis的代谢通量平衡模型

2.1.3 B.subtilis核黄素生产菌的生理参数

2.1.4 B.subtilis生物量组分

2.2结果与讨论

2.2.1 B.subtilis核黄素生产菌的代谢通量计算

2.2.2 B.subtilis核黄素生产菌的NADPH需求

2.2.3 B.subtilis核黄素生产菌TCA循环及PPP通量的理论需求

2.2.4 B.subtilis核黄素生产菌的生物能学分析

2.3本章小结

第三章B.subtilis质粒的消除

3.1实验材料

3.1.1菌种

3.1.2主要仪器

3.1.3主要试剂

3.1.4培养基

3.1.5主要溶液

3.2实验方法

3.2.1质粒的消除

3.2.2质粒丢失的检测

3.2.3质粒的提取

3.2.4质粒的琼脂糖凝胶电泳鉴定

3.2.5发酵条件

3.2.6核黄素的定量检测方法

3.3实验结果与讨论

3.3.1吖啶橙对B.subtilis24/pMX45质粒的消除

3.3.2 SDS对B.subtilis24/pMX45质粒的消除

3.3.3原生质体再生对B.subtilis24/pMX45质粒的消除

3.3.4提高培养温度对B.subtilis24/pMX45质粒的消除

3.3.5质粒被消除的菌株与原始菌之间生理性状的差异

3.4本章小结

第四章Bacillus subtilis核黄素重组质粒的构建

4.1实验材料

4.1.1菌种

4.1.2主要仪器

4.1.3主要试剂

4.1.4培养基

4.1.5主要溶液

4.2实验方法

4.2.1质粒的提取

4.2.2 PCR扩增

4.2.3 DNA的酶切

4.2.4 DNA片断的分离

4.2.5 DNA的转化

4.2.6转化子DNA的快速鉴定

4.3实验结果与讨论

4.3.1质粒pMX45的提取

4.3.2 B.subtilis核黄素操纵子的PCR扩增

4.3.3重组质粒的构建与转化E.coliHB101

4.4本章小结

第五章Bacillus subtilis重组质粒转化受体菌的研究

5.1实验材料

5.1.1菌种及质粒

5.1.2主要仪器

5.1.3主要试剂

5.1.4培养基

5.1.5主要溶液

5.2实验方法

5.2.1 Spizizen转化法

5.2.2 OTB转化法

5.2.3原生质体转化

5.2.4核酸酶对质粒DNA的降解

5.2.5高效液相色谱法测定核黄素

5.3实验结果与讨论

5.3.1重组质粒对B.subtilis天然感受态细胞的转化

5.3.2重组质粒pRF46对B.subtilis24A7原生质体的转化

5.3.3核酸酶对pRF46的降解

5.3.4重组质粒pRF46转化B.subtilis24A7原生质体的条件优化

5.3.5 Bacillus subtilis24/pRF46主要发酵产物的定性及定量

5.4本章小结

第六章枯草芽孢杆菌全局调节子与核黄素发酵的关系

6.1理论阐述

6.1.1PTS的结构与功能

6.1.2 PTS对B.subtilis碳源运输的调控

6.1.3 Hpr蛋白对B.subtilis碳代谢的调控

6.1.4全局调节子CcpA对B.subtilis碳分解代谢阻遏的调控

6.1.5 CcpA介导的碳分解代谢阻遏

6.1.6 CcpA对Bacillus subtilis溢流代谢的调节

6.2实验材料

6.2.1菌种

6.2.2主要仪器

6.2.3主要试剂

6.2.4培养基

6.3实验方法

6.3.1发酵条件

6.3.2生物量的测定

6.3.3核黄素的测定

6.3.4发酵液中还原糖的测定

6.4实验结果与讨论

6.4.1 CcpA介导的葡萄糖分解代谢阻遏

6.4.2 PTS对B.subtilis核黄素发酵的影响

6.4.3氮源与碳分解代谢产物阻遏效应的关系

6.5本章小结

第七章结论与展望

7.1结论

7.2展望

附录

参考文献

论文发表

致谢